A doença de Alzheimer (DA) carece de biomarcadores proteicos que reflitam sua múltipla fisiopatologia subjacente, dificultando o progresso do diagnóstico e do tratamento. Aqui, usamos proteômica abrangente para identificar biomarcadores do líquido cefalorraquidiano (LCR) que representam uma ampla gama de fisiopatologia da DA. A espectrometria de massa multiplex identificou aproximadamente 3.500 e aproximadamente 12.000 proteínas no LCR da DA e no cérebro, respectivamente. A análise de rede do proteoma cerebral resolveu 44 módulos de biodiversidade, 15 dos quais se sobrepuseram ao proteoma do líquido cefalorraquidiano. Os marcadores de DA no LCR nestes módulos sobrepostos são dobrados em cinco grupos de proteínas, representando diferentes processos fisiopatológicos. As sinapses e metabólitos no cérebro com DA diminuem, mas o LCR aumenta, enquanto a mielinização rica em glia e os grupos imunológicos no cérebro e no LCR aumentam. A consistência e a especificidade da doença das alterações do painel foram confirmadas em mais de 500 amostras adicionais de LCR. Esses grupos também identificaram subgrupos biológicos na DA assintomática. No geral, estes resultados são um passo promissor em direção a ferramentas de biomarcadores baseadas na web para aplicações clínicas na DA.
A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência neurodegenerativa em todo o mundo e é caracterizada por uma ampla gama de disfunções do sistema biológico, incluindo transmissão sináptica, imunidade mediada pela glia e metabolismo mitocondrial (1-3). No entanto, os seus biomarcadores proteicos estabelecidos ainda se concentram na detecção da proteína amiloide e tau e, portanto, não podem refletir esta fisiopatologia diversificada. Esses biomarcadores proteicos “centrais” que são medidos de forma mais confiável no líquido cefalorraquidiano (LCR) incluem (i) peptídeo beta amilóide 1-42 (Aβ1-42), que reflete a formação de placas amilóides corticais; (ii) tau total, sinal de degeneração do axônio; (iii) fosfo-tau (p-tau), um representante da hiperfosforilação patológica da tau (4-7). Embora estes biomarcadores do líquido cefalorraquidiano tenham facilitado enormemente a nossa detecção de doenças “marcadas” das proteínas da DA (4-7), eles representam apenas uma pequena parte da biologia complexa por trás da doença.
A falta de diversidade fisiopatológica dos biomarcadores da DA levou a muitos desafios, incluindo (i) a incapacidade de identificar e quantificar a heterogeneidade biológica dos pacientes com DA, (ii) medição insuficiente da gravidade e progressão da doença, especialmente na fase pré-clínica, e ( iii) o desenvolvimento de medicamentos terapêuticos que não conseguiram resolver completamente todos os aspectos da deterioração neurológica. Nossa confiança na patologia de referência para descrever a DA de doenças relacionadas apenas agrava esses problemas. Cada vez mais evidências mostram que a maioria dos idosos com demência apresenta mais de uma característica patológica de declínio cognitivo (8). Até 90% ou mais dos indivíduos com patologia da DA também apresentam doença vascular, inclusões de TDP-43 ou outras doenças degenerativas (9). Estas elevadas proporções de sobreposição patológica perturbaram o nosso quadro diagnóstico atual para a demência, sendo necessária uma definição fisiopatológica mais abrangente da doença.
Tendo em conta a necessidade urgente de uma variedade de biomarcadores para a DA, a área está a adoptar cada vez mais o método “ómico” baseado no sistema global para descobrir biomarcadores. A Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance foi lançada em 2014 e está na vanguarda do programa. Este esforço multidisciplinar dos Institutos Nacionais de Saúde, da academia e da indústria visa utilizar estratégias baseadas em sistemas para definir melhor a fisiopatologia da DA e desenvolver análises de diagnóstico da biodiversidade e estratégias de tratamento (10). Como parte deste projeto, a proteômica de rede tornou-se uma ferramenta promissora para o avanço de biomarcadores baseados em sistemas na DA. Esta abordagem imparcial baseada em dados organiza conjuntos complexos de dados proteômicos em grupos ou “módulos” de proteínas co-expressas que estão associadas a tipos de células, organelas e funções biológicas específicas (11-13). Quase 12 estudos de proteômica de redes ricas em informações foram conduzidos no cérebro com DA (13-23). No geral, estas análises indicam que o proteoma da rede cerebral da DA mantém uma organização modular altamente conservada em coortes independentes e múltiplas regiões corticais. Além disso, alguns destes módulos mostram alterações reprodutíveis na abundância relacionada com a DA em conjuntos de dados, refletindo a fisiopatologia de múltiplas doenças. Coletivamente, essas descobertas demonstram um ponto de ancoragem promissor para a descoberta do proteoma da rede cerebral como um biomarcador baseado em sistema na DA.
A fim de transformar o proteoma da rede cerebral da DA em biomarcadores baseados em sistemas clinicamente úteis, combinamos a rede derivada do cérebro com a análise proteômica do LCR da DA. Esta abordagem integrada levou à identificação de cinco conjuntos promissores de biomarcadores do LCR que estão associados a uma ampla gama de fisiopatologia cerebral, incluindo sinapses, vasos sanguíneos, mielinização, inflamação e disfunção de vias metabólicas. Validamos com sucesso esses painéis de biomarcadores por meio de múltiplas análises de replicação, incluindo mais de 500 amostras de LCR de diversas doenças neurodegenerativas. Essas análises de validação incluem o exame de alvos de grupo no LCR de pacientes com DA assintomática (AsymAD) ou a demonstração de evidências de acúmulo anormal de amiloide em um ambiente cognitivo normal. Estas análises destacam a heterogeneidade biológica significativa na população AsymAD e identificam marcadores de painel que podem ser capazes de subtipar indivíduos nos estágios iniciais da doença. No geral, estes resultados representam um passo fundamental no desenvolvimento de ferramentas de biomarcadores proteicos baseados em múltiplos sistemas que podem resolver com sucesso muitos dos desafios clínicos enfrentados pela DA.
O objetivo principal deste estudo é identificar novos biomarcadores do líquido cefalorraquidiano que refletem várias fisiopatologias cerebrais que levam à DA. A Figura S1 descreve nossa metodologia de pesquisa, que inclui (i) uma análise abrangente conduzida por descobertas preliminares do AD CSF e do proteoma cerebral da rede para identificar vários biomarcadores de doenças do LCR relacionados ao cérebro e (ii) replicação subsequente. coortes fluidas. A pesquisa orientada para a descoberta começou com a análise da expressão diferencial do LCR em 20 indivíduos cognitivamente normais e 20 pacientes com DA no Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). O diagnóstico de DA é definido como um comprometimento cognitivo significativo na presença de Aβ1-42 baixo e níveis elevados de tau total e p-tau no líquido cefalorraquidiano [Avaliação Cognitiva Média de Montreal (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Tabela S1A). O controle (MoCA médio, 26,7 ± 2,2) apresentou níveis normais de biomarcadores no LCR.
O LCR humano é caracterizado por uma faixa dinâmica de abundância de proteínas, na qual a albumina e outras proteínas extremamente abundantes podem impedir a detecção de proteínas de interesse (24). Para aumentar a profundidade da descoberta de proteínas, removemos as primeiras 14 proteínas altamente abundantes de cada amostra de LCR antes da análise por espectrometria de massa (MS) (24). Um total de 39.805 peptídeos foram identificados por MS, que foram mapeados para 3.691 proteomas em 40 amostras. A quantificação de proteínas é realizada por marcação múltipla em tandem mass tag (TMT) (18, 25). Para resolver os dados faltantes, incluímos apenas as proteínas que foram quantificadas em pelo menos 50% das amostras na análise subsequente, quantificando finalmente 2.875 proteomas. Devido à diferença significativa nos níveis de abundância total de proteínas, uma amostra de controle foi estatisticamente considerada um valor discrepante (13) e não foi incluída na análise subsequente. Os valores de abundância das 39 amostras restantes foram ajustados de acordo com idade, sexo e covariância do lote (13-15, 17, 18, 20, 26).
Utilizando a análise estatística do teste t para avaliar a expressão diferencial no conjunto de dados de regressão, esta análise identificou proteínas cujos níveis de abundância foram significativamente alterados (P <0,05) entre os casos de controle e de DA (Tabela S2A). Como mostrado na Figura 1A, a abundância de um total de 225 proteínas na DA foi significativamente reduzida e a abundância de 303 proteínas aumentou significativamente. Essas proteínas diferencialmente expressas incluem vários marcadores de DA do líquido cefalorraquidiano previamente identificados, como proteína tau associada a microtúbulos (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilamento (NEFL; P = 6,56 × 10−3), proteína 43 relacionada ao crescimento. (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Proteína de ligação a ácidos graxos 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Quitinase 3 como 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Granulina Neural (NRGN; P = 3,43 × 10−4) e fator de crescimento nervoso VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). No entanto, também identificamos outros alvos muito importantes, como o inibidor de dissociação do PIB 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) e a ligação modular de cálcio 1 relacionada ao SPARC (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). A análise da Gene Ontology (GO) de 225 proteínas significativamente reduzidas revelou conexões estreitas com processos de fluidos corporais, como metabolismo de esteróides, coagulação sanguínea e atividade hormonal (Figura 1B e Tabela S2B). Em contraste, o aumento significativo da proteína 303 está intimamente relacionado à estrutura celular e ao metabolismo energético.
(A) O gráfico do vulcão mostra a alteração log2 vezes (eixo x) em relação ao valor P estatístico -log10 (eixo y) obtido pelo teste t, que é usado para detectar expressão diferencial entre o controle (CT) e Casos de DA do proteoma do LCR de todas as proteínas. As proteínas com níveis significativamente reduzidos (P <0,05) na DA são mostradas em azul, enquanto as proteínas com níveis significativamente aumentados na doença são mostradas em vermelho. A proteína selecionada é rotulada. (B) Os principais termos GO relacionados à proteína são significativamente reduzidos (azul) e aumentados (vermelho) na DA. Mostra os três termos GO com as pontuações z mais altas nas áreas de processos biológicos, funções moleculares e componentes celulares. (C) MS mediu o nível de MAPT na amostra de LCR (esquerda) e sua correlação com o nível de tau ELISA da amostra (direita). O coeficiente de correlação de Pearson com o valor P relevante é exibido. Devido à falta de dados ELISA para um caso de DA, estes números incluem valores para 38 dos 39 casos analisados. (D) Análise de cluster supervisionada (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) ajustado P <0,01) no controle e AD CSF encontrou amostras usando as 65 proteínas mais significativamente alteradas no conjunto de dados. Padronize, normalize.
O nível proteômico do MAPT está intimamente relacionado ao nível de tau ELISA medido independentemente (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Figura 1C), apoiando a validade da nossa medição MS. Após a digestão com tripsina ao nível da proteína precursora de amilóide (APP), os péptidos específicos da isoforma mapeados no terminal C de Aβ1-40 e Aβ1-42 não podem ser ionizados eficientemente (27, 28). Portanto, os peptídeos APP que identificamos não têm nada a ver com os níveis de ELISA Aβ1-42. Para avaliar a expressão diferencial de cada caso, utilizamos proteínas diferencialmente expressas com P <0,0001 [taxa de descoberta falsa (FDR) corrigida P <0,01] para realizar uma análise de agrupamento supervisionada das amostras (Tabela S2A). Como mostrado na Figura 1D, estas 65 proteínas altamente significativas podem agrupar corretamente amostras de acordo com o estado da doença, exceto para um caso de DA com características semelhantes às do controle. Destas 65 proteínas, 63 aumentaram na DA, enquanto apenas duas (CD74 e ISLR) diminuíram. No total, estas análises do líquido cefalorraquidiano identificaram centenas de proteínas na DA que podem servir como biomarcadores da doença.
Em seguida, realizamos uma análise de rede independente do proteoma cerebral da DA. A coorte cerebral desta descoberta incluiu o córtex pré-frontal dorsolateral (DLPFC) de casos de controle (n = 10), doença de Parkinson (DP; n = 10), DA/PD mista (n = 10) e DA (n = 10). ) Amostra. Emery Goizueta ADRC. A demografia destes 40 casos foi descrita anteriormente (25) e está resumida na Tabela S1B. Usamos TMT-MS para analisar esses 40 tecidos cerebrais e a coorte de replicação de 27 casos. No total, estes dois conjuntos de dados cerebrais produziram 227.121 peptídeos únicos, que foram mapeados em 12.943 proteomas (25). Apenas as proteínas quantificadas em pelo menos 50% dos casos foram incluídas nas investigações subsequentes. O conjunto final de dados de descoberta contém 8.817 proteínas quantificadas. Ajuste os níveis de abundância de proteínas com base na idade, sexo e intervalo post-mortem (PMI). A análise de expressão diferencial do conjunto de dados após a regressão mostrou que >2.000 níveis de proteína foram significativamente alterados [P <0,05, análise de variância (ANOVA)] em duas ou mais coortes de doenças. Em seguida, realizamos uma análise de cluster supervisionada com base nas proteínas diferencialmente expressas e P <0,0001 nas comparações AD/controle e/ou AD/PD (Figura S2, A e B, Tabela S2C). Estas 165 proteínas altamente alteradas representam claramente casos com patologia da DA a partir das amostras de controlo e DP, confirmando as fortes alterações específicas da DA em todo o proteoma.
Em seguida, usamos um algoritmo chamado Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) para realizar análises de rede no proteoma cerebral descoberto, que organiza o conjunto de dados em módulos de proteínas com padrões de expressão semelhantes (11-13). A análise identificou 44 módulos (M) de proteínas co-expressas, classificadas e numeradas do maior (M1, n = 1821 proteínas) ao menor (M44, n = 34 proteínas) (Figura 2A e Tabela S2D). Conforme mencionado acima (13) Calcular o perfil de expressão representativo ou proteína característica de cada módulo, e correlacioná-lo com o estado da doença e a patologia da DA, ou seja, estabelecer a aliança do Registro da Doença de Alzheimer (CERAD) e do Braak Score (Figura 2B). No geral, 17 módulos foram significativamente relacionados à neuropatologia da DA (P<0,05). Muitos destes módulos relacionados com doenças também são ricos em marcadores específicos do tipo celular (Figura 2B). Como mencionado acima (13), o enriquecimento do tipo celular é determinado pela análise da sobreposição do módulo e da lista de referência de genes específicos do tipo celular. Esses genes são derivados de dados publicados em neurônios isolados de camundongos, células endoteliais e gliais. Experimento de sequenciamento de RNA (RNA-seq) (29).
(A) Descubra o WGCNA do proteoma cerebral. (B) Análise de correlação média de peso médio (BiCor) da proteína de assinatura modular (o primeiro componente principal da expressão proteica modular) com características neuropatológicas da DA (topo), incluindo pontuações CERAD (placa Aβ) e Braak (emaranhados de tau). As intensidades das correlações positivas (vermelhas) e negativas (azul) são mostradas por um mapa de calor de duas cores, e os asteriscos indicam significância estatística (P <0,05). Use o Teste Exato de Fisher Hipergeométrico (FET) (parte inferior) para avaliar a associação do tipo celular de cada módulo de proteína. A intensidade do sombreado vermelho indica o grau de enriquecimento do tipo celular e o asterisco indica significância estatística (P<0,05). Use o método BH para corrigir o valor P derivado do FET. (C) Análise GO de proteínas modulares. Os processos biológicos mais intimamente relacionados são mostrados para cada módulo ou grupo de módulos relacionados. oligo, oligodendrócito.
Um conjunto de cinco módulos ricos em astrócitos e microglia intimamente relacionados (M30, M29, M18, M24 e M5) mostrou uma forte correlação positiva com a neuropatologia da DA (Figura 2B). A análise ontológica liga esses módulos gliais ao crescimento, proliferação e imunidade celular (Figura 2C e Tabela S2E). Dois módulos gliais adicionais, M8 e M22, também são fortemente regulados positivamente na doença. M8 está altamente relacionado com a via do receptor Toll-like, uma cascata de sinalização que desempenha um papel fundamental na resposta imune inata (30). Ao mesmo tempo, o M22 está intimamente relacionado à modificação pós-traducional. M2, que é rico em oligodendrócitos, apresenta uma forte correlação positiva com a patologia da DA e uma ligação ontológica com a síntese de nucleosídeos e replicação de DNA, indicando maior proliferação celular em doenças. No geral, estas descobertas apoiam a elevação dos módulos gliais que observamos anteriormente no proteoma da rede AD (13, 17). Atualmente, verifica-se que muitos módulos gliais relacionados à DA na rede apresentam níveis de expressão mais baixos nos casos controle e de DP, destacando a especificidade da doença que é elevada na DA (Figura S2C).
Apenas quatro módulos em nosso proteoma de rede (M1, M3, M10 e M32) estão fortemente correlacionados negativamente com a patologia da DA (P <0,05) (Figura 2, B e C). Tanto M1 quanto M3 são ricos em marcadores neuronais. M1 está altamente relacionado aos sinais sinápticos, enquanto M3 está intimamente relacionado à função mitocondrial. Não há evidência de enriquecimento do tipo celular para M10 e M32. M32 reflete a conexão entre M3 e o metabolismo celular, enquanto M10 está altamente relacionado ao crescimento celular e à função dos microtúbulos. Em comparação com a DA, todos os quatro módulos são aumentados no controle e na DP, proporcionando alterações específicas da doença (Figura S2C). No geral, estes resultados apoiam a diminuição da abundância de módulos ricos em neurônios que observamos anteriormente na DA (13, 17). Em resumo, a análise de rede do proteoma cerebral que descobrimos produziu módulos alterados especificamente para a DA, consistentes com nossas descobertas anteriores.
A DA é caracterizada por um estágio assintomático precoce (AsymAD), no qual os indivíduos apresentam acúmulo de amiloide sem declínio cognitivo clínico (5, 31). Este estágio assintomático representa uma janela crítica para detecção e intervenção precoces. Demonstramos anteriormente uma forte preservação modular do proteoma da rede cerebral AsymAD e AD em conjuntos de dados independentes (13, 17). Para garantir que a rede cerebral que descobrimos atualmente seja consistente com essas descobertas anteriores, analisamos a preservação de 44 módulos no conjunto de dados replicados de 27 organizações DLPFC. Essas organizações incluem casos de controle (n = 10), AsymAD (n = 8) e AD (n = 9). Amostras de controle e DA foram incluídas na análise de nossa coorte cerebral de descoberta (Tabela S1B), enquanto os casos de AsymAD foram únicos apenas na coorte de replicação. Esses casos AsymAD também vieram do banco de cérebros Emory Goizueta ADRC. Embora a cognição estivesse normal no momento da morte, os níveis de amiloide estavam anormalmente elevados (média CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tabela S1B).
A análise TMT-MS destes 27 tecidos cerebrais resultou na quantificação de 11.244 proteomas. Esta contagem final inclui apenas as proteínas quantificadas em pelo menos 50% das amostras. Este conjunto de dados replicados contém 8.638 (98,0%) das 8.817 proteínas detectadas em nossa análise cerebral de descoberta, e tem quase 3.000 proteínas alteradas significativamente entre as coortes controle e AD (P <0,05, após o teste t pareado de Tukey para análise de variância) ( Tabela S2F). Entre essas proteínas diferencialmente expressas, 910 também mostrou alterações significativas de nível entre os casos de DA e de controle do proteoma cerebral (P <0,05, após teste t pareado ANOVA Tukey). Vale a pena notar que estes 910 marcadores são altamente consistentes na direção da mudança entre proteomas (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figura S3A). Entre as proteínas aumentadas, as proteínas com as alterações mais consistentes entre os conjuntos de dados são principalmente membros dos módulos M5 e M18 ricos em glia (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 e GFAP). Entre as proteínas reduzidas, aquelas com alterações mais consistentes foram quase exclusivamente membros do módulo M1 (NPTX2, VGF e RPH3A) associados à sinapse. Verificamos ainda as alterações relacionadas à DA de midkine (MDK), CD44, proteína 1 relacionada ao frizzled secretada (SFRP1) e VGF por western blotting (Figura S3B). A análise de preservação do módulo mostrou que cerca de 80% dos módulos de proteína (34/44) no proteoma cerebral foram significativamente conservados no conjunto de dados de replicação (escore z> 1,96, FDR corrigido P <0,05) (Figura S3C). Quatorze desses módulos foram especialmente reservados entre os dois proteomas (escore z> 10, P corrigido por FDR <1,0 × 10-23). No geral, a descoberta e replicação do alto grau de consistência na expressão diferencial e na composição modular entre o proteoma cerebral destaca a reprodutibilidade das alterações nas proteínas do córtex frontal da DA. Além disso, também confirmou que a AsymAD e doenças mais avançadas têm uma estrutura de rede cerebral muito semelhante.
Uma análise mais detalhada da expressão diferencial no conjunto de dados de replicação cerebral destaca o grau significativo de alterações na proteína AsymAD, incluindo um total de 151 proteínas significativamente alteradas entre AsymAD e o controle (P <0,05) (Figura S3D). Consistente com a carga amilóide, a APP no cérebro de AsymAD e AD aumentou significativamente. O MAPT só muda significativamente na DA, o que é consistente com o aumento dos níveis de emaranhados e a sua conhecida correlação com o declínio cognitivo (5, 7). Os módulos ricos em glia (M5 e M18) são altamente refletidos nas proteínas aumentadas no AsymAD, enquanto o módulo M1 relacionado aos neurônios é o mais representativo das proteínas diminuídas no AsymAD. Muitos desses marcadores AsymAD apresentam alterações maiores em doenças sintomáticas. Entre esses marcadores está o SMOC1, uma proteína glial pertencente ao M18, que está associada a tumores cerebrais e ao desenvolvimento de olhos e membros (32). MDK é um fator de crescimento de ligação à heparina relacionado ao crescimento celular e à angiogênese (33), outro membro do M18. Comparado com o grupo controle, o AsymAD aumentou significativamente, seguido por um aumento maior na DA. Em contraste, a proteína sináptica neuropentraxina 2 (NPTX2) foi significativamente reduzida no cérebro AsymAD. O NPTX2 foi previamente associado à neurodegeneração e tem um papel reconhecido na mediação de sinapses excitatórias (34). No geral, estes resultados revelam uma variedade de diferentes alterações proteicas pré-clínicas na DA que parecem progredir com a gravidade da doença.
Dado que alcançámos uma profundidade significativa de cobertura proteica na descoberta do proteoma cerebral, estamos a tentar compreender mais completamente a sua sobreposição com o transcriptoma da DA ao nível da rede. Portanto, comparamos o proteoma cerebral que descobrimos com o módulo que geramos anteriormente a partir da medição de microarranjos de 18.204 genes em tecidos DLPFC de DA (n = 308) e controle (n = 157) (13). sobreposição. No total, identificamos 20 módulos de RNA diferentes, muitos dos quais demonstraram o enriquecimento de tipos celulares específicos, incluindo neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia (Figura 3A). As múltiplas alterações desses módulos no AD são mostradas na Figura 3B. Consistente com nossa análise anterior de sobreposição de proteína-RNA usando o proteoma MS não marcado mais profundo (cerca de 3.000 proteínas) (13), a maioria dos 44 módulos na rede de proteoma cerebral que encontramos estão na rede de transcriptoma. nossa descoberta e replicação dos 34 módulos de proteína que são altamente retidos no proteoma cerebral, apenas 14 (~40%) passaram no teste exato de Fisher (FET) provou ter uma sobreposição estatisticamente significativa com o transcriptoma (Figura 3A). Compatível com reparo de danos ao DNA (P-M25 e P-M19), tradução de proteínas (P-M7 e P-M20), ligação/splicing de RNA (P-M16 e P-M21) e direcionamento de proteínas (P-M13 e P- M23) não se sobrepõe aos módulos do transcriptoma. Portanto, embora um conjunto de dados de proteoma mais profundo seja usado na análise de sobreposição atual (13), a maior parte do proteoma da rede AD não está mapeada para a rede do transcriptoma.
(A) FET hipergeométrico demonstra o enriquecimento de marcadores específicos do tipo celular no módulo de RNA do transcriptoma AD (topo) e o grau de sobreposição entre os módulos de RNA (eixo x) e proteína (eixo y) do cérebro AD (fundo) . A intensidade do sombreamento vermelho indica o grau de enriquecimento dos tipos de células no painel superior e a intensidade da sobreposição dos módulos no painel inferior. Os asteriscos indicam significância estatística (P<0,05). (B) O grau de correlação entre os genes característicos de cada módulo do transcriptoma e o status da DA. Os módulos à esquerda são os mais correlacionados negativamente com AD (azul), e os da direita são os mais correlacionados positivamente com AD (vermelho). O valor P corrigido por BH transformado em log indica o grau de significância estatística de cada correlação. (C) Módulos sobrepostos significativos com enriquecimento de tipo de célula compartilhado. (D) Análise de correlação da alteração log2 vezes da proteína marcada (eixo x) e RNA (eixo y) no módulo sobreposto. O coeficiente de correlação de Pearson com o valor P relevante é exibido. Micro, microglia; corpos celestes, astrócitos. TC, controle.
A maioria dos módulos sobrepostos de proteína e RNA compartilham perfis de enriquecimento de tipo celular semelhantes e direções de mudança de AD consistentes (Figura 3, B e C). Em outras palavras, o módulo M1 relacionado à sinapse do proteoma cerebral (PM1) é mapeado em três módulos de RNA homólogos ricos em neurônios (R-M1, R-M9 e R-M16), que estão na DA. um nível reduzido. Da mesma forma, os módulos de proteína M5 e M18 ricos em glia se sobrepõem a módulos de RNA ricos em astrócitos e marcadores microgliais (R-M3, R-M7 e R-M10) e estão altamente envolvidos no aumento de doenças. Esses recursos modulares compartilhados entre os dois conjuntos de dados apoiam ainda mais o enriquecimento do tipo celular e as mudanças relacionadas a doenças que observamos no proteoma cerebral. No entanto, observamos muitas diferenças significativas entre os níveis de RNA e proteína de marcadores individuais nestes módulos compartilhados. A análise de correlação da expressão diferencial da proteômica e transcriptômica das moléculas dentro desses módulos sobrepostos (Figura 3D) destaca essa inconsistência. Por exemplo, APP e várias outras proteínas do módulo glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 e SFRP1) mostraram um aumento significativo no proteoma da DA, mas quase não houve alteração no transcriptoma da DA. Estas alterações específicas de proteínas podem estar intimamente relacionadas com placas amilóides (23, 35), destacando o proteoma como fonte de alterações patológicas, e estas alterações podem não ser refletidas no transcriptoma.
Depois de analisar independentemente os proteomas cerebrais e do LCR que descobrimos, conduzimos uma análise abrangente dos dois conjuntos de dados para identificar biomarcadores da DA no LCR relacionados à fisiopatologia da rede cerebral. Devemos primeiro definir a sobreposição dos dois proteomas. Embora seja amplamente aceito que o LCR reflete alterações neuroquímicas no cérebro com DA (4), o grau exato de sobreposição entre o cérebro com DA e o proteoma do LCR não é claro. Ao comparar o número de produtos genéticos compartilhados detectados em nossos dois proteomas, descobrimos que quase 70% (n = 1936) das proteínas identificadas no líquido cefalorraquidiano também foram quantificadas no cérebro (Figura 4A). A maioria dessas proteínas sobrepostas (n = 1721) são mapeadas para um dos 44 módulos de coexpressão do conjunto de dados do cérebro de descoberta (Figura 4B). Como esperado, os seis maiores módulos cerebrais (M1 a M6) exibiram a maior quantidade de sobreposição do LCR. No entanto, existem módulos cerebrais mais pequenos (por exemplo, M15 e M29) que atingem um grau de sobreposição inesperadamente elevado, maior do que um módulo cerebral com o dobro do seu tamanho. Isso nos motiva a adotar um método mais detalhado e estatisticamente orientado para calcular a sobreposição entre o cérebro e o líquido cefalorraquidiano.
(A e B) As proteínas detectadas nos conjuntos de dados do cérebro descoberto e do LCR se sobrepõem. A maioria dessas proteínas sobrepostas está associada a um dos 44 módulos de coexpressão da rede de coexpressão cerebral. (C) Descubra a sobreposição entre o proteoma do líquido cefalorraquidiano e o proteoma da rede cerebral. Cada linha do mapa de calor representa uma análise de sobreposição separada do FET hipergeométrico. A linha superior representa a sobreposição (sombreamento cinza/preto) entre o módulo cerebral e todo o proteoma do LCR. A segunda linha mostra que a sobreposição entre os módulos cerebrais e a proteína do LCR (sombreado em vermelho) é significativamente regulada positivamente na DA (P <0,05). A terceira linha mostra que a sobreposição entre os módulos cerebrais e a proteína do LCR (sombreamento azul) é significativamente regulada negativamente na DA (P <0,05). Use o método BH para corrigir o valor P derivado do FET. (D) Painel de módulo dobrável baseado na associação de tipo de célula e termos GO relacionados. Esses painéis contêm um total de 271 proteínas relacionadas ao cérebro, que possuem expressão diferencial significativa no proteoma do LCR.
Usando FETs unicaudais, avaliamos a importância da sobreposição de proteínas entre o proteoma do LCR e os módulos cerebrais individuais. A análise revelou que um total de 14 módulos cerebrais no conjunto de dados do LCR têm sobreposições estatisticamente significativas (FDR ajustado P <0,05) e um módulo adicional (M18) cuja sobreposição é próxima da significância (FDR ajustado P = 0,06) (Figura 4C , linha superior). Também estamos interessados em módulos que se sobrepõem fortemente às proteínas do LCR expressas diferencialmente. Portanto, aplicamos duas análises FET adicionais para determinar qual (i) a proteína do LCR estava significativamente aumentada na DA e (ii) a proteína do LCR estava significativamente diminuída na DA (P <0,05, teste t pareado AD/controle) Módulos cerebrais com sobreposição significativa entre eles. Como mostrado nas linhas intermediárias e inferiores da Figura 4C, essas análises adicionais mostram que 8 dos 44 módulos cerebrais se sobrepõem significativamente à proteína adicionada no AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 e M38) . ), enquanto apenas dois módulos (M6 e M15) mostraram uma sobreposição significativa com a proteína reduzida no LCR com DA. Como esperado, todos os 10 módulos estão nos 15 módulos com maior sobreposição com o proteoma do LCR. Portanto, assumimos que esses 15 módulos são fontes de alto rendimento de biomarcadores de LCR derivados do cérebro da DA.
Dobramos esses 15 módulos sobrepostos em cinco grandes painéis de proteínas com base em sua proximidade no diagrama de árvore WGCNA e sua associação com tipos de células e ontologia genética (Figura 4D). O primeiro painel contém módulos ricos em marcadores neuronais e proteínas relacionadas a sinapses (M1 e M12). O painel sináptico contém um total de 94 proteínas, e os níveis no proteoma do LCR mudaram significativamente, tornando-o a maior fonte de marcadores do LCR relacionados ao cérebro entre os cinco painéis. O segundo grupo (M6 e M15) demonstrou a estreita ligação com marcadores de células endoteliais e do corpo vascular, como “cicatrização de feridas” (M6) e “regulação da resposta imune humoral” (M15). M15 também está altamente relacionado ao metabolismo das lipoproteínas, que está intimamente relacionado ao endotélio (36). O painel vascular contém 34 marcadores do LCR relacionados ao cérebro. O terceiro grupo inclui módulos (M2 e M4) que estão significativamente relacionados com marcadores de oligodendrócitos e proliferação celular. Por exemplo, os termos de ontologia de nível superior de M2 incluem “regulação positiva da replicação do DNA” e “processo de biossíntese de purinas”. Enquanto isso, os de M4 incluem “diferenciação de células gliais” e “segregação cromossômica”. O painel de mielinização contém 49 marcadores do LCR relacionados ao cérebro.
O quarto grupo contém a maioria dos módulos (M30, M29, M18, M24 e M5), e quase todos os módulos são significativamente ricos em microglia e marcadores de astrócitos. Semelhante ao painel de mielinização, o quarto painel também contém módulos (M30, M29 e M18) que estão intimamente relacionados com a proliferação celular. Os demais módulos deste grupo estão altamente relacionados a termos imunológicos, como “processo de efeito imunológico” (M5) e “regulação da resposta imune” (M24). O grupo imune glial contém 42 marcadores do LCR relacionados ao cérebro. Finalmente, o último painel inclui 52 marcadores relacionados ao cérebro nos quatro módulos (M44, M3, M33 e M38), todos relacionados ao armazenamento de energia e ao metabolismo. O maior destes módulos (M3) está intimamente relacionado com as mitocôndrias e é rico em marcadores específicos de neurônios. M38 é um dos membros do módulo menor neste metaboloma e também exibe especificidade neuronal moderada.
No geral, estes cinco painéis refletem uma ampla gama de tipos de células e funções no córtex da DA e contêm coletivamente 271 marcadores do LCR relacionados ao cérebro (Tabela S2G). Para avaliar a validade desses resultados de MS, usamos o ensaio de extensão de proximidade (PEA), uma tecnologia ortogonal baseada em anticorpos com capacidades de multiplexação, alta sensibilidade e especificidade, e reanalisamos as amostras de líquido cefalorraquidiano que encontramos. Um subconjunto desses 271 biomarcadores (n = 36). Esses 36 alvos demonstram a mudança no múltiplo AD da PEA, que está intimamente relacionado às nossas descobertas baseadas em MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), que verificaram fortemente os resultados de nossa análise abrangente de MS (Figura S4 ).
Os temas biológicos enfatizados pelos nossos cinco grupos, desde a sinalização sináptica ao metabolismo energético, estão todos relacionados com a patogénese da DA (1-3). Portanto, todos os 15 módulos contendo estes painéis estão relacionados com a patologia da DA no proteoma cerebral que descobrimos (Figura 2B). O mais notável é a alta correlação patológica positiva entre os nossos módulos gliais e a forte correlação patológica negativa entre os nossos maiores módulos neuronais (M1 e M3). A análise de expressão diferencial do nosso proteoma cerebral replicado (Figura S3D) também destaca proteínas gliais derivadas de M5 e M18. Na AsymAD e na DA sintomática, as proteínas gliais mais aumentadas e as sinapses relacionadas a M1 A proteína é a mais reduzida. Estas observações indicam que os 271 marcadores do líquido cefalorraquidiano que identificamos nos cinco grupos estão relacionados com processos de doença no córtex da DA, incluindo aqueles que ocorrem nos estágios iniciais assintomáticos.
A fim de analisar melhor a direção da mudança das proteínas do painel no cérebro e no líquido espinhal, desenhamos o seguinte para cada um dos 15 módulos sobrepostos: (i) encontramos o nível de abundância do módulo no conjunto de dados do cérebro e (ii) o módulo proteína A diferença é expressa no líquido cefalorraquidiano (Figura S5). Como mencionado anteriormente, o WGCNA é usado para determinar a abundância do módulo ou o valor característico da proteína no cérebro (13). O mapa do vulcão é usado para descrever a expressão diferencial de proteínas modulares no líquido cefalorraquidiano (AD/controle). Estes números mostram que três dos cinco painéis mostram diferentes tendências de expressão no cérebro e no líquido espinhal. Os dois módulos do painel de sinapse (M1 e M12) mostram uma diminuição no nível de abundância no cérebro da DA, mas se sobrepõem significativamente ao aumento da proteína no LCR da DA (Figura S5A). Os módulos relacionados aos neurônios contendo o metaboloma (M3 e M38) mostraram padrões semelhantes de expressão cerebral e do líquido cefalorraquidiano inconsistentes (Figura S5E). O painel vascular também mostrou diferentes tendências de expressão, embora seus módulos (M6 e M15) estivessem moderadamente aumentados no cérebro com DA e diminuídos no LCR doente (Figura S5B). Os dois painéis restantes contêm grandes redes gliais cujas proteínas são consistentemente reguladas positivamente em ambos os compartimentos (Figura S5, C e D).
Observe que essas tendências não são comuns a todos os marcadores nesses painéis. Por exemplo, o painel sináptico inclui várias proteínas que são significativamente reduzidas no cérebro da DA e no LCR (Figura S5A). Entre esses marcadores de líquido cefalorraquidiano regulados negativamente estão NPTX2 e VGF de M1 e cromogranina B de M12. No entanto, apesar dessas exceções, a maioria dos nossos marcadores sinápticos está elevada no líquido espinhal da DA. No geral, estas análises foram capazes de distinguir tendências estatisticamente significativas nos níveis do cérebro e do líquido cefalorraquidiano em cada um dos nossos cinco painéis. Essas tendências destacam a relação complexa e muitas vezes diferente entre a expressão de proteínas no cérebro e no LCR na DA.
Em seguida, usamos a análise de replicação de MS de alto rendimento (replicação 1 do LCR) para restringir nosso conjunto de 271 biomarcadores aos alvos mais promissores e reprodutíveis (Figura 5A). A cópia 1 do LCR contém um total de 96 amostras de Emory Goizueta ADRC, incluindo controle, AsymAD e coorte de AD (Tabela S1A). Esses casos de DA são caracterizados por declínio cognitivo leve (MoCA médio, 20,0 ± 3,8) e alterações nos biomarcadores de DA confirmados no líquido cefalorraquidiano (Tabela S1A). Ao contrário da análise do LCR que encontramos, esta replicação é realizada usando um método MS de “injeção única” mais eficiente e de alto rendimento (sem fracionamento off-line), incluindo um protocolo simplificado de preparação de amostras que elimina a necessidade de imunodepleção de amostras individuais . Em vez disso, um único “canal de aprimoramento” imunodepletado é usado para amplificar o sinal de proteínas menos abundantes (37). Embora reduza a cobertura total do proteoma, este método de disparo único reduz significativamente o tempo da máquina e aumenta o número de amostras marcadas com TMT que podem ser analisadas viáveis (17, 38). No total, a análise identificou 6.487 peptídeos, que mapearam 1.183 proteomas em 96 casos. Tal como acontece com a análise do LCR, descobrimos que apenas as proteínas quantificadas em pelo menos 50% das amostras foram incluídas nos cálculos subsequentes, e os dados foram regredidos para os efeitos da idade e do sexo. Isto levou à quantificação final de 792 proteomas, 95% dos quais também foram identificados no conjunto de dados do LCR encontrado.
(A) Alvos proteicos do LCR relacionados ao cérebro verificados na primeira coorte replicada do LCR e incluídos no painel final (n = 60). (B a E) Níveis de biomarcadores do painel (escore z compostos) medidos nas quatro coortes de replicação do LCR. Testes t pareados ou ANOVA com pós-correção de Tukey foram utilizados para avaliar a significância estatística das mudanças na abundância em cada análise replicada. TC, controle.
Uma vez que estamos particularmente interessados em verificar os nossos 271 alvos de LCR relacionados com o cérebro através de uma análise abrangente, limitaremos um exame mais aprofundado deste proteoma replicado a estes marcadores. Entre estas 271 proteínas, 100 foram detectadas na replicação 1 do LCR. A Figura S6A mostra a expressão diferencial destes 100 marcadores sobrepostos entre as amostras de controlo e de replicação de AD. As histonas sinápticas e metabólicas aumentam mais na DA, enquanto as proteínas vasculares diminuem mais na doença. A maioria dos 100 marcadores sobrepostos (n = 70) manteve a mesma direção de mudança nos dois conjuntos de dados (Figura S6B). Estes 70 marcadores validados do LCR relacionados com o cérebro (Tabela S2H) refletem em grande parte as tendências de expressão do painel previamente observadas, isto é, a regulação negativa das proteínas vasculares e a regulação positiva de todos os outros painéis. Apenas 10 destas 70 proteínas validadas mostraram alterações na abundância de DA que contradiziam estas tendências do painel. A fim de gerar um painel que melhor reflita a tendência geral do cérebro e do líquido cefalorraquidiano, excluímos essas 10 proteínas do painel de interesse que finalmente verificamos (Figura 5A). Portanto, nosso painel inclui, em última análise, um total de 60 proteínas verificadas em duas coortes independentes de DA no LCR usando diferentes preparações de amostras e análise de plataforma MS. Os gráficos de expressão do escore z desses painéis finais no controle da cópia 1 do LCR e nos casos de DA confirmaram a tendência do painel observada na coorte do LCR que encontramos (Figura 5B).
Entre essas 60 proteínas, existem moléculas conhecidas por estarem associadas à DA, como a osteopontina (SPP1), que é uma citocina pró-inflamatória que tem sido associada à DA em muitos estudos (39-41), e GAP43, uma proteína sináptica isso está claramente ligado à neurodegeneração (42). As proteínas mais completamente verificadas são marcadores relacionados a outras doenças neurodegenerativas, como a superóxido dismutase 1 (SOD1) relacionada à esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a dessacarase relacionada à doença de Parkinson (PARK7). Também verificamos que muitos outros marcadores, como o SMOC1 e a proteína 1 de sinalização de ligação à membrana rica em cérebro (BASP1), limitaram ligações anteriores à neurodegeneração. Vale a pena notar que, devido à sua baixa abundância geral no proteoma do LCR, é difícil para nós usar este método de detecção de disparo único de alto rendimento para detectar de forma confiável MAPT e algumas outras proteínas relacionadas à DA (por exemplo, NEFL e NRGN ) ( 43, 44).
Em seguida, verificamos esses 60 marcadores de painel prioritários em três análises replicadas adicionais. Na CSF Copy 2, usamos um único TMT-MS para analisar uma coorte independente de 297 amostras de controle e AD de Emory Goizueta ADRC (17). A replicação 3 do LCR incluiu uma reanálise dos dados disponíveis de TMT-MS de 120 pacientes controle e com DA de Lausanne, Suíça (45). Detectamos mais de dois terços dos 60 marcadores prioritários em cada conjunto de dados. Embora o estudo suíço tenha utilizado diferentes plataformas MS e métodos de quantificação de TMT (45, 46), reproduzimos fortemente as tendências do nosso painel em duas análises repetidas (Figura 5, C e D, e Tabelas S2, I e J). Para avaliar a especificidade da doença do nosso grupo, utilizamos TMT-MS para analisar o quarto conjunto de dados de replicação (replicação 4 do LCR), que incluiu não apenas casos de controle (n = 18) e DA (n = 17), mas também DP ( n = 14)), amostras de ELA (n = 18) e demência frontotemporal (DFT) (n = 11) (Tabela S1A). Quantificamos com sucesso quase dois terços das proteínas do painel nesta coorte (38 de 60). Estes resultados destacam as alterações específicas da DA em todos os cinco painéis de biomarcadores (Figura 5E e Tabela S2K). O aumento no grupo metabólito apresentou a especificidade mais forte para AD, seguido pelo grupo mielinização e glial. Em menor grau, o FTD também apresenta um aumento entre estes painéis, o que pode refletir potenciais alterações de rede semelhantes (17). Em contraste, ELA e DP mostraram quase os mesmos perfis de mielinização, glia e metaboloma que o grupo controle. No geral, apesar das diferenças na preparação de amostras, na plataforma MS e nos métodos de quantificação de TMT, essas análises repetidas mostram que nossos marcadores de painel prioritário têm alterações específicas de DA altamente consistentes em mais de 500 amostras únicas de LCR.
A neurodegeneração da DA foi amplamente reconhecida vários anos antes do início dos sintomas cognitivos, pelo que existe uma necessidade urgente de biomarcadores de AsymAD (5, 31). No entanto, cada vez mais evidências mostram que a biologia da AsymAD está longe de ser homogênea, e a interação complexa de risco e resiliência leva a grandes diferenças individuais na progressão subsequente da doença (47). Embora utilizados para identificar casos de AsymAD, os níveis dos principais biomarcadores do LCR (Aβ1-42, tau total e p-tau) não provaram ser capazes de prever com segurança quem irá progredir para demência (4, 7), indicando mais. necessário incluir ferramentas holísticas de biomarcadores baseadas em múltiplos aspectos da fisiologia cerebral para estratificar com precisão o risco desta população. Portanto, analisamos posteriormente nosso painel de biomarcadores validados por AD na população AsymAD da cópia 1 do LCR. Esses 31 casos de AsymAD mostraram níveis anormais de biomarcadores centrais (relação Aβ1-42/tau total ELISA, <5,5) e cognição completa (MoCA médio, 27,1 ± 2,2) (Tabela S1A). Além disso, todos os indivíduos com AsymAD apresentam uma pontuação clínica de demência de 0, indicando que não há evidência de declínio no desempenho cognitivo ou funcional diário.
Analisamos primeiro os níveis dos painéis validados em todas as 96 réplicas de LCR 1, incluindo a coorte AsymAD. Descobrimos que vários painéis do grupo AsymAD apresentaram alterações significativas na abundância do tipo AD, o painel vascular mostrou uma tendência decrescente no AsymAD, enquanto todos os outros painéis mostraram uma tendência ascendente (Figura 6A). Portanto, todos os painéis mostraram uma correlação altamente significativa com o ELISA Aβ1-42 e os níveis totais de tau (Figura 6B). Em contraste, a correlação entre o grupo e a pontuação do MoCA é relativamente fraca. Uma das descobertas mais surpreendentes dessas análises é a grande variedade de abundâncias de painéis na coorte AsymAD. Como mostrado na Figura 6A, o nível do painel do grupo AsymAD geralmente cruza o nível do painel do grupo controle e do grupo AD, mostrando uma variabilidade relativamente alta. Para explorar ainda mais essa heterogeneidade do AsymAD, aplicamos a análise Multidimensional Scaling (MDS) a 96 casos de replicação 1 do LCR. A análise MDS permite visualizar a semelhança entre os casos com base em determinadas variáveis do conjunto de dados. Para esta análise de cluster, usamos apenas os marcadores de painel validados que apresentam uma alteração estatisticamente significativa (P <0,05, AD/controle) no nível de descoberta e replicação 1 do LCR (n = 29) (Tabela S2L). Esta análise produziu um agrupamento espacial claro entre nossos casos de controle e de DA (Figura 6C). Em contraste, alguns casos de AsymAD estão claramente agrupados no grupo de controle, enquanto outros estão localizados em casos de DA. Para explorar ainda mais essa heterogeneidade do AsymAD, usamos nosso mapa MDS para definir dois grupos desses casos de AsymAD. O primeiro grupo incluiu casos de AsymAD agrupados mais próximos do controle (n = 19), enquanto o segundo grupo foi caracterizado por casos de AsymAD com perfil de marcador mais próximo da DA (n = 12).
(A) O nível de expressão (pontuação z) do grupo de biomarcadores do LCR em todas as 96 amostras da coorte de replicação 1 do LCR, incluindo AsymAD. A análise de variância com pós-correção de Tukey foi utilizada para avaliar a significância estatística das mudanças na abundância do painel. (B) Análise de correlação do nível de abundância de proteína do painel (pontuação z) com pontuação MoCA e nível total de tau em amostras de ELISA Aβ1-42 e cópia 1 de LCR. O coeficiente de correlação de Pearson com o valor P relevante é exibido. (C) O MDS de 96 casos de cópia 1 do LCR baseou-se nos níveis de abundância de 29 marcadores de painel validados, que foram significativamente alterados nos conjuntos de dados de descoberta e cópia 1 do LCR [P <0,05 AD/controle (CT)]. Esta análise foi utilizada para dividir o grupo AsymAD em subgrupos controle (n = 19) e AD (n = 12). (D) O gráfico do vulcão mostra a expressão diferencial de todas as proteínas de replicação 1 do LCR com alteração log2 vezes (eixo x) em relação ao valor P estatístico -log10 entre os dois subgrupos AsymAD. Os biomarcadores do painel são coloridos. (E) O nível de abundância de replicação 1 do LCR dos biomarcadores do grupo de seleção é expresso diferencialmente entre os subgrupos AsymAD. A análise de variância pós-ajustada de Tukey foi utilizada para avaliar a significância estatística.
Examinamos a expressão diferencial de proteínas entre esses casos de controle e AsymAD tipo AD (Figura 6D e Tabela S2L). O mapa do vulcão resultante mostra que 14 marcadores do painel mudaram significativamente entre os dois grupos. A maioria desses marcadores são membros da sinapse e do metaboloma. No entanto, a SOD1 e o substrato da proteína quinase C rica em alanina miristoilada (MARCKS), que são membros dos grupos imunes da mielina e da glia, respectivamente, também pertencem a este grupo (Figura 6, D e E). O painel vascular também contribuiu com dois marcadores que foram significativamente reduzidos no grupo AsymAD semelhante à DA, incluindo a proteína 1 de ligação a AE (AEBP1) e o membro da família do complemento C9. Não houve diferença significativa entre os subgrupos controle e AsymAD tipo AD no ELISA AB1-42 (P = 0,38) e p-tau (P = 0,28), mas houve de fato uma diferença significativa no nível total de tau (P = 0,0031). ) (Fig. S7). Existem vários marcadores de painel que indicam que as alterações entre os dois subgrupos AsymAD são mais significativas que os níveis totais de tau (por exemplo, YWHAZ, SOD1 e MDH1) (Figura 6E). No geral, esses resultados indicam que nosso painel validado pode conter biomarcadores que podem subtipo e potencial estratificação de risco de pacientes com doença assintomática.
Há uma necessidade urgente de ferramentas de biomarcadores baseados em sistemas para melhor medir e direcionar as diversas fisiopatologias por trás da DA. Espera-se que estas ferramentas não só mudem o nosso quadro de diagnóstico da DA, mas também promovam a adopção de estratégias de tratamento eficazes e específicas para o paciente (1, 2). Para este fim, aplicamos uma abordagem proteômica abrangente e imparcial ao cérebro e LCR da DA para identificar biomarcadores de LCR baseados na web que refletem uma ampla gama de fisiopatologia baseada no cérebro. Nossa análise produziu cinco painéis de biomarcadores do LCR, que (i) refletem sinapses, vasos sanguíneos, mielina, disfunção imunológica e metabólica; (ii) demonstrar forte reprodutibilidade em diferentes plataformas MS; (iii) Mostrar alterações progressivas específicas da doença ao longo dos estágios iniciais e finais da DA. No geral, essas descobertas representam um passo promissor em direção ao desenvolvimento de ferramentas de biomarcadores diversificadas, confiáveis e orientadas para a web, para pesquisas e aplicações clínicas na DA.
Nossos resultados demonstram a organização altamente conservada do proteoma da rede cerebral da DA e apoiam seu uso como uma âncora para o desenvolvimento de biomarcadores baseados em sistema. Nossa análise mostra que dois conjuntos de dados TMT-MS independentes contendo cérebros AD e AsymAD têm forte modularidade. Estas descobertas ampliam o nosso trabalho anterior, demonstrando a preservação dos poderosos módulos de mais de 2.000 tecidos cerebrais de múltiplas coortes independentes no córtex frontal, parietal e temporal (17). Esta rede de consenso reflete várias alterações relacionadas com doenças observadas na investigação atual, incluindo o aumento de módulos inflamatórios ricos em glias e a diminuição de módulos ricos em neurônios. Tal como a investigação actual, esta rede em grande escala também apresenta alterações modulares significativas no AsymAD, mostrando uma variedade de diferentes fisiopatologias pré-clínicas (17).
No entanto, dentro desta estrutura baseada em sistemas altamente conservadores, há uma heterogeneidade biológica mais refinada, especialmente entre indivíduos nos estágios iniciais da DA. Nosso painel de biomarcadores é capaz de representar dois subgrupos no AsymAD, que demonstram a expressão diferencial significativa de múltiplos marcadores do LCR. Nosso grupo conseguiu destacar as diferenças biológicas entre esses dois subgrupos, que não eram óbvias no nível dos principais biomarcadores da DA. Em comparação com o grupo de controle, as proporções Aβ1-42/tau total desses indivíduos AsymAD foram anormalmente baixas. No entanto, apenas os níveis totais de tau foram significativamente diferentes entre os dois subgrupos AsymAD, enquanto os níveis de Aβ1-42 e p-tau permaneceram relativamente comparáveis. Como a tau elevada no LCR parece ser um melhor preditor de sintomas cognitivos do que os níveis de Aβ1-42 (7), suspeitamos que as duas coortes de AsymAD possam ter riscos diferentes de progressão da doença. Dado o tamanho limitado da amostra do nosso AsymAD e a falta de dados longitudinais, são necessárias mais pesquisas para tirar estas conclusões com segurança. No entanto, estes resultados indicam que um painel de LCR baseado em sistema pode aumentar a nossa capacidade de estratificar eficazmente os indivíduos durante a fase assintomática da doença.
No geral, nossas descobertas apoiam o papel de múltiplas funções biológicas na patogênese da DA. No entanto, o metabolismo energético desregulado tornou-se o tema proeminente de todos os nossos cinco painéis de rotulagem validados. Proteínas metabólicas, como a hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase 1 (HPRT1) e a lactato desidrogenase A (LDHA), são os biomarcadores sinápticos mais robustamente validados, indicando que o aumento no LCR da DA é sexo altamente reprodutível. Nossos vasos sanguíneos e painéis gliais também contêm vários marcadores envolvidos no metabolismo de substâncias oxidativas. Estas descobertas são consistentes com o papel fundamental que os processos metabólicos desempenham em todo o cérebro, não só para satisfazer a elevada procura de energia dos neurónios, mas também para satisfazer a elevada procura de energia dos astrócitos e outras células gliais (17, 48). Os nossos resultados apoiam evidências crescentes de que as alterações no potencial redox e a interrupção das vias energéticas podem ser o elo central entre vários processos-chave envolvidos na patogénese da DA, incluindo distúrbios mitocondriais, inflamação mediada pela glia e danos vasculares (49). Além disso, os biomarcadores metabólicos do líquido cefalorraquidiano contêm um grande número de proteínas diferencialmente ricas entre nossos subgrupos controle e AsymAD tipo AD, sugerindo que a interrupção dessas vias energéticas e redox pode ser crítica no estágio pré-clínico da doença .
As diferentes tendências do painel cerebral e do líquido cefalorraquidiano que observamos também têm implicações biológicas interessantes. Sinapses e metabolomas ricos em neurônios mostram níveis diminuídos no cérebro com DA e aumento da abundância no líquido cefalorraquidiano. Dado que os neurônios são ricos em mitocôndrias produtoras de energia nas sinapses para fornecer energia para seus numerosos sinais especializados (50), é esperada a semelhança dos perfis de expressão desses dois grupos de neurônios. A perda de neurônios e a extrusão de células danificadas podem explicar essas tendências do painel cerebral e do LCR em doenças posteriores, mas não podem explicar as alterações iniciais do painel que observamos (13). Uma possível explicação para esses achados na doença assintomática precoce é a poda sináptica anormal. Novas evidências em modelos de camundongos sugerem que a fagocitose sináptica mediada por microglia pode ser anormalmente ativada na DA e levar à perda precoce de sinapses no cérebro (51). Esse material sináptico descartado pode se acumular no LCR, por isso observamos o aumento do LCR no painel de neurônios. A poda sináptica imunomediada também pode explicar parcialmente o aumento das proteínas gliais que observamos no cérebro e no líquido cefalorraquidiano ao longo do processo da doença. Além da poda sináptica, anormalidades gerais na via exocítica também podem levar a diferentes expressões de marcadores neuronais no cérebro e no LCR. Vários estudos demonstraram que o conteúdo dos exossomos na patogênese do cérebro com DA mudou (52). A via extracelular também está envolvida na proliferação de Aβ (53, 54). Vale a pena notar que a supressão da secreção exossômica pode reduzir a patologia semelhante à DA em modelos de camundongos transgênicos com DA (55).
Ao mesmo tempo, a proteína no painel vascular mostrou um aumento moderado no cérebro com DA, mas diminuiu significativamente no LCR. A disfunção da barreira hematoencefálica (BHE) pode explicar parcialmente esses achados. Muitos estudos independentes post-mortem em humanos demonstraram a quebra da BHE na DA (56, 57). Estes estudos confirmaram várias atividades anormais em torno desta camada hermeticamente fechada de células endoteliais, incluindo vazamento capilar cerebral e acumulação perivascular de proteínas transmitidas pelo sangue (57). Isto pode fornecer uma explicação simples para as proteínas vasculares elevadas no cérebro, mas não pode explicar completamente a depleção dessas mesmas proteínas no líquido cefalorraquidiano. Uma possibilidade é que o sistema nervoso central esteja isolando ativamente essas moléculas para resolver o problema do aumento da inflamação e do estresse oxidativo. A redução de algumas das proteínas mais graves do LCR neste painel, especialmente aquelas envolvidas na regulação das lipoproteínas, está relacionada à inibição de níveis prejudiciais de inflamação e ao processo neuroprotetor de espécies reativas de oxigênio. Isto é verdade para a Paroxonase 1 (PON1), uma enzima de ligação às lipoproteínas responsável pela redução dos níveis de stress oxidativo na circulação (58, 59). O precursor da alfa-1-microglobulina/bicunina (AMBP) é outro marcador significativamente regulado negativamente do grupo vascular. É o precursor do transportador lipídico bicunina, que também está envolvido na supressão da inflamação e na proteção neurológica (60, 61).
Apesar de várias hipóteses interessantes, a incapacidade de detectar diretamente mecanismos bioquímicos de doenças é uma limitação bem conhecida da análise proteômica orientada por descobertas. Portanto, mais pesquisas são necessárias para definir com segurança os mecanismos por trás desses painéis de biomarcadores. A fim de avançar para o desenvolvimento de análises clínicas baseadas em EM, a direção futura também requer a utilização de métodos quantitativos direcionados para verificação de biomarcadores em larga escala, tais como monitorização de reações seletivas ou paralelas (62). Recentemente, utilizamos o monitoramento de reações paralelas (63) para validar muitas das alterações nas proteínas do LCR descritas aqui. Vários alvos de painel prioritários são quantificados com precisão significativa, incluindo YWHAZ, ALDOA e SMOC1, que mapeiam nossos painéis de sinapse, metabolismo e inflamação, respectivamente (63). A Aquisição Independente de Dados (DIA) e outras estratégias baseadas em MS também podem ser úteis para a verificação de alvos. Bud et al. (64) Foi recentemente demonstrado que existe uma sobreposição significativa entre os biomarcadores da DA identificados no nosso conjunto de dados de descoberta de LCR e o conjunto de dados independente DIA-MS, que consiste em quase 200 amostras de LCR de três coortes europeias diferentes. Esses estudos recentes apoiam o potencial de nossos painéis se transformarem em detecção confiável baseada em MS. A detecção tradicional baseada em anticorpos e aptâmeros também é importante para o desenvolvimento dos principais biomarcadores da DA. Devido à baixa abundância de LCR, é mais difícil detectar esses biomarcadores usando métodos de MS de alto rendimento. NEFL e NRGN são dois exemplos de biomarcadores de LCR de baixa abundância, que são mapeados no painel em nossa análise abrangente, mas não podem ser detectados de forma confiável usando nossa estratégia única de MS. Estratégias de direcionamento baseadas em múltiplos anticorpos, como o PEA, podem promover a transformação clínica desses marcadores.
No geral, este estudo fornece uma abordagem proteômica única para a identificação e verificação de biomarcadores de DA no LCR com base em diferentes sistemas. A otimização desses painéis de marcadores em coortes adicionais de DA e plataformas de EM pode ser promissora para avançar na estratificação e no tratamento do risco de DA. Estudos que avaliam o nível longitudinal destes painéis ao longo do tempo também são fundamentais para determinar qual combinação de marcadores estratifica melhor o risco de doença precoce e alterações na gravidade da doença.
Exceto pelas 3 amostras copiadas pelo LCR, todas as amostras de LCR utilizadas neste estudo foram coletadas sob os auspícios do Emory ADRC ou de instituições de pesquisa estreitamente relacionadas. Um total de quatro conjuntos de amostras de LCR Emory foram utilizados nesses estudos proteômicos. Descobriu-se que a coorte de LCR continha amostras de 20 controles saudáveis e 20 pacientes com DA. A cópia 1 do LCR inclui amostras de 32 controles saudáveis, 31 indivíduos com AsymAD e 33 indivíduos com DA. A cópia 2 do LCR contém 147 controles e 150 amostras de AD. A coorte de replicação 4 do LCR multi-doença incluiu 18 amostras de controles, 17 AD, 19 ALS, 13 PD e 11 amostras de FTD. De acordo com o acordo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Emory University, todos os participantes do estudo Emory obtiveram consentimento informado. De acordo com as Diretrizes de Melhores Práticas do Instituto Nacional de Envelhecimento para Centros de Alzheimer de 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), o líquido cefalorraquidiano foi coletado e armazenado por punção lombar. Os pacientes controle e AsymAD e AD receberam avaliação cognitiva padronizada na Emory Cognitive Neurology Clinic ou Goizueta ADRC. Suas amostras de líquido cefalorraquidiano foram testadas pelo INNO-BIA AlzBio3 Luminex para ELISA Aβ1-42, análise de tau total e p-tau (65). Os valores de ELISA são usados para apoiar a classificação diagnóstica de indivíduos com base nos critérios de corte estabelecidos para biomarcadores de DA (66, 67). Dados demográficos e diagnósticos básicos para outros diagnósticos de LCR (FTD, ALS e PD) também são obtidos no Emory ADRC ou em instituições de pesquisa afiliadas. Os metadados resumidos desses casos de LCR Emory podem ser encontrados na Tabela S1A. As características da coorte suíça de replicação 3 do LCR foram publicadas anteriormente (45).
O LCR encontrou a amostra. A fim de aumentar a profundidade da nossa descoberta do conjunto de dados do LCR, o consumo imunológico de proteínas de alta abundância foi realizado antes da tripsinização. Resumindo, 130 μl de LCR de 40 amostras individuais de LCR e um volume igual (130 μl) de resina de depleção de proteínas de abundância High Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) foram colocados em uma coluna de rotação (Thermo Fisher Scientific, A89868) na sala temperatura Incubar). Após girar por 15 minutos, centrifugue a amostra a 1000g por 2 minutos. Um dispositivo de filtro ultracentrífugo 3K (Millipore, UFC500396) foi utilizado para concentrar a amostra de efluente por centrifugação a 14.000g por 30 minutos. Diluir todos os volumes de amostra para 75 μl com solução salina tamponada com fosfato. A concentração proteica foi avaliada pelo método do ácido bicinconínico (BCA) de acordo com o protocolo do fabricante (Thermo Fisher Scientific). O LCR imunodepletado (60 μl) de todas as 40 amostras foi digerido com lisil endopeptidase (LysC) e tripsina. Resumindo, a amostra foi reduzida e alquilada com 1,2 μl de tris-2 (-carboxietil) -fosfina 0,5 M e 3 μl de cloroacetamida 0,8 M a 90 ° C por 10 minutos e depois sonicada em banho-maria por 15 minutos. A amostra foi diluída com 193 μl de tampão de ureia 8 M [ureia 8 M e NaHPO4 100 mM (pH 8,5)] até uma concentração final de ureia 6 M. LysC (4,5 μg; Wako) é usado para digestão durante a noite à temperatura ambiente. A amostra foi então diluída para ureia 1 M com bicarbonato de amônio (ABC) 50 mM (68). Adicione uma quantidade igual (4,5 μg) de tripsina (Promega) e incube a amostra por 12 horas. Acidifique a solução peptídica digerida até uma concentração final de 1% de ácido fórmico (FA) e 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) (66) e, em seguida, dessalinize com uma coluna Sep-Pak C18 de 50 mg (Waters) conforme descrito acima (25) . O péptido foi então eluído em 1 ml de acetonitrilo a 50% (ACN). Para padronizar a quantificação de proteínas entre lotes (25), alíquotas de 100 μl de todas as 40 amostras de LCR foram combinadas para gerar uma amostra mista, que foi então dividida em cinco amostras de padrão interno global (GIS) (48). Todas as amostras individuais e padrões combinados são secos por vácuo de alta velocidade (Labconco).
O LCR copia a amostra. Dayon e colegas descreveram anteriormente a depleção imunológica e a digestão de amostras da cópia 3 do LCR (45, 46). As restantes amostras replicadas não estavam individualmente imunodepletadas. Digerir essas amostras não removidas em tripsina conforme descrito anteriormente (17). Para cada análise repetida, alíquotas de 120 μl do peptídeo eluído de cada amostra foram reunidas e divididas em alíquotas de volumes iguais para serem usadas como padrão interno global marcado com TMT (48). Todas as amostras individuais e padrões combinados são secos por vácuo de alta velocidade (Labconco). A fim de aumentar o sinal da proteína de baixa abundância no LCR, combinando 125 μl de cada amostra, uma amostra “melhorada” foi preparada para cada análise replicada [ou seja, uma amostra biológica que imita a amostra de pesquisa, mas a quantidade disponível é muito maior (37, 69)] fundidos em uma amostra mista de LCR (17). A amostra mista foi então imunoremovida utilizando 12 ml de resina de remoção de proteína High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372), digerida como descrito acima e incluída na subsequente marcação múltipla de TMT.
Horário da postagem: 27 de agosto de 2021