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Termófilos são microrganismos que prosperam em altas temperaturas. Estudá-los pode fornecer informações valiosas sobre como a vida se adapta a condições extremas. No entanto, é difícil conseguir condições de alta temperatura com microscópios ópticos convencionais. Várias soluções caseiras baseadas em aquecimento elétrico resistivo local foram propostas, mas não existe uma solução comercial simples. Neste artigo, apresentamos o conceito de aquecimento a laser em microescala sobre o campo de visão do microscópio para fornecer altas temperaturas para estudos termófilos, mantendo o ambiente do usuário ameno. O aquecimento em microescala com intensidade moderada de laser pode ser alcançado usando um substrato revestido com nanopartículas de ouro como um absorvedor de luz biocompatível e eficiente. Possíveis efeitos da convecção de fluidos em microescala, retenção celular e movimento termoforético centrífugo são discutidos. O método foi demonstrado em duas espécies: (i) Geobacillus stearothermophilus, uma bactéria termofílica ativa que se reproduz a cerca de 65°C, que observamos germinar, crescer e nadar sob aquecimento em microescala; (ii) Thiobacillus sp., uma archaea idealmente hipertermofílica. a 80°C. Este trabalho abre caminho para a observação simples e segura de microrganismos termofílicos utilizando ferramentas de microscopia modernas e acessíveis.
Ao longo de milhares de milhões de anos, a vida na Terra evoluiu para se adaptar a uma vasta gama de condições ambientais que são por vezes consideradas extremas da nossa perspectiva humana. Em particular, alguns microrganismos termofílicos (bactérias, archaea, fungos) chamados termófilos prosperam na faixa de temperatura de 45°C a 122°C1, 2, 3, 4. Os termófilos vivem em vários ecossistemas, como fontes hidrotermais profundas, fontes termais ou áreas vulcânicas. Sua pesquisa gerou muito interesse nas últimas décadas por pelo menos dois motivos. Primeiro, podemos aprender com eles, por exemplo, como os termófilos 5, 6, as enzimas 7, 8 e as membranas 9 são estáveis a temperaturas tão elevadas, ou como os termófilos podem suportar níveis extremos de radiação10. Em segundo lugar, eles são a base para muitas aplicações biotecnológicas importantes1,11,12, como produção de combustível13,14,15,16, síntese química (di-hidro, álcoois, metano, aminoácidos, etc.)17, biomineração18 e biocatalisadores termoestáveis7,11, 13. Em particular, a atualmente conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR)19 envolve uma enzima (Taq polimerase) isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, uma das primeiras termófilas a serem descobertas.
Porém, o estudo dos termófilos não é uma tarefa fácil e não pode ser improvisado em nenhum laboratório biológico. Em particular, termófilos vivos não podem ser observados in vitro com qualquer microscópio óptico padrão, mesmo com câmaras de aquecimento disponíveis comercialmente, geralmente classificadas para temperaturas tão baixas quanto 40°C. Desde a década de 1990, apenas alguns grupos de pesquisa se dedicaram à introdução de sistemas de microscopia de alta temperatura (HTM). Em 1994 Glukh et al. A câmara de aquecimento/resfriamento foi concebida com base na utilização de uma célula Peltier que controla a temperatura de capilares retangulares fechados para manter a anaerobicidade 20 . O aparelho pode ser aquecido até 100 °C a uma taxa de 2 °C/s, permitindo aos autores estudar a motilidade da bactéria hipertermofílica Thermotoga maritima21. Em 1999, Horn et al. Foi desenvolvido um dispositivo muito semelhante, ainda baseado na utilização de capilares aquecidos adequados à microscopia comercial para estudar a divisão/conexão celular. Após um longo período de relativa inatividade, a busca por HTMs eficazes foi retomada em 2012, principalmente em conexão com uma série de artigos do grupo Wirth que utilizaram um dispositivo inventado por Horn et al. Há quinze anos, a motilidade de um grande número de archaea, incluindo hipertermófilos, foi estudada em temperaturas de até 100°C utilizando capilares aquecidos . Eles também modificaram o microscópio original para obter um aquecimento mais rápido (vários minutos em vez de 35 minutos para atingir a temperatura definida) e obter um gradiente linear de temperatura de mais de 2 cm no meio. Este dispositivo de modelagem de gradiente de temperatura (TGFD) tem sido usado para estudar a mobilidade de muitos termófilos dentro de gradientes de temperatura em distâncias biologicamente relevantes 24, 25.
O aquecimento de capilares fechados não é a única maneira de observar termófilos vivos. Em 2012, Kuwabara et al. Foram utilizadas câmaras Pyrex descartáveis caseiras seladas com adesivo resistente ao calor (Super X2; Cemedine, Japão). As amostras foram colocadas em uma placa de aquecimento transparente disponível comercialmente (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japão) capaz de aquecer até 110°C, mas não originalmente destinada à bioimagem. Os autores observaram divisão eficiente de bactérias anaeróbias termofílicas (Thermosipho globiformans, tempo de duplicação 24 min) a 65°C. Em 2020, Pulshen et al. O aquecimento eficiente de pratos metálicos comerciais (AttofluorTM, Thermofisher) foi demonstrado usando dois elementos de aquecimento caseiros: uma tampa e um palco (configuração inspirada na máquina de PCR). Esta associação resulta numa temperatura uniforme do líquido e evita a evaporação e condensação no fundo da tampa. O uso de um O-ring evita trocas gasosas com o meio ambiente. Este HTM, chamado Sulfoscópio, foi usado para visualizar Sulfolobus acidocaldarius a 75°C27.
Uma limitação reconhecida de todos esses sistemas foi a restrição ao uso de objetivas de ar, sendo qualquer imersão em óleo inadequada para temperaturas tão altas e para geração de imagens através de amostras transparentes com espessura> 1 mm. Uma limitação reconhecida de todos esses sistemas foi a restrição ao uso de objetivas de ar, sendo qualquer imersão em óleo inadequada para temperaturas tão altas e para geração de imagens através de amostras transparentes com espessura> 1 mm. Общепризнанным недостатком seu sistema estará funcionando corretamente, O modo de imersão em óleo não pode ser usado para a temperatura ambiente e para a visualização do processo рачные образцы толщиной > 1 mm. Uma deficiência reconhecida de todos esses sistemas foi a limitação ao uso de objetivas de ar, uma vez que qualquer imersão em óleo não era adequada para temperaturas tão altas e para visualização através de amostras transparentes > 1 mm de espessura.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1米厚的透明样品成像。 Uma limitação reconhecida de todos esses sistemas é a limitação do uso de um espelho com entrada de ar, já que qualquer imersão em óleo é inadequada para gerar imagens de amostras transparentes com mais de 1 mm de espessura em temperaturas tão altas. Общепризнанным недостатком seu sistema está funcionando corretamente, e имерсионное погружение в масло непригодно para tal temperatura e visualização de operação толщиной >1 mm. Uma desvantagem reconhecida de todos estes sistemas é o uso limitado de lentes de ar, qualquer imersão em óleo é inadequada para temperaturas tão altas e visualização através de amostras transparentes com >1 mm de espessura.Mais recentemente, esta limitação foi levantada por Charles-Orzag et al. 28, que desenvolveu um dispositivo que não fornece mais calor ao redor do sistema de interesse, mas sim dentro da própria lamela de vidro, coberta por uma fina camada transparente de um resistor feito de ITO (óxido de índio-estanho). A tampa pode ser aquecida até 75 °C passando uma corrente elétrica através da camada transparente. Porém, o autor também deve aquecer a lente até a objetiva, mas não mais que 65 °C, para não danificá-la.
Esses trabalhos mostram que o desenvolvimento de microscopia óptica eficiente de alta temperatura não tem sido amplamente adotado, muitas vezes requer equipamentos caseiros e muitas vezes é alcançado ao custo da resolução espacial, o que é uma séria desvantagem, visto que os microrganismos termofílicos não são maiores do que alguns micrômetros. O volume de aquecimento reduzido é a chave para resolver três problemas inerentes ao HTM: baixa resolução espacial, alta inércia térmica quando o sistema aquece e aquecimento prejudicial dos elementos circundantes (óleo de imersão, lentes objetivas... ou mãos do usuário) em temperaturas extremas. ).
Neste artigo, apresentamos um HTM para observação termófila que não é baseado em aquecimento resistivo. Em vez disso, conseguimos aquecimento localizado dentro de uma região limitada do campo de visão do microscópio por irradiação a laser de um substrato absorvente de luz. A distribuição de temperatura foi visualizada por microscopia quantitativa de fase (QPM). A eficácia deste método é demonstrada por Geobacillus stearothermophilus, uma bactéria termofílica móvel que se reproduz a cerca de 65°C e tem um curto tempo de duplicação (cerca de 20 minutos), e Sulfolobus shibatae, uma hipertermófila que cresce optimamente a 80°C (archaea). para ilustrar. Taxa normal de replicação e natação foram observadas em função da temperatura. Este laser HTM (LA-HTM) não é limitado pela espessura da lamela ou pela natureza da objetiva (imersão em ar ou óleo). Isso permite que qualquer lente de alta resolução do mercado seja usada. Também não sofre aquecimento lento devido à inércia térmica (atinge aquecimento instantâneo na escala de milissegundos) e utiliza apenas componentes disponíveis comercialmente. As únicas novas preocupações de segurança estão relacionadas com a presença de poderosos raios laser (normalmente até 100 mW) no interior do dispositivo e possivelmente através dos olhos, que requerem óculos de proteção.
O princípio do LA-HTM é usar um laser para aquecer a amostra localmente dentro do campo de visão do microscópio (Fig. 1a). Para fazer isso, a amostra deve absorver luz. Para utilizar uma potência de laser razoável (menos de 100 mW), não confiamos na absorção de luz pelo meio líquido, mas aumentamos artificialmente a absorção da amostra revestindo o substrato com nanopartículas de ouro (Fig. 1c). O aquecimento de nanopartículas de ouro com luz é de fundamental importância para o campo da plasmônica térmica, com aplicações esperadas em biomedicina, nanoquímica ou captação de luz solar29,30,31. Nos últimos anos, temos utilizado este LA-HTM em diversos estudos relacionados a aplicações de plasma térmico em física, química e biologia. A principal dificuldade deste método está na visualização do perfil de temperatura final, uma vez que a temperatura elevada é limitada a uma região de microescala dentro da amostra. Mostramos que o mapeamento de temperatura pode ser alcançado com o interferômetro de cisalhamento transversal de quatro comprimentos de onda, um método simples, de alta resolução e muito sensível de microscopia de fase quantitativa baseado no uso de redes de difração bidimensionais (também conhecidas como redes cruzadas) 33,34,35,36. A confiabilidade desta técnica de microscopia térmica, baseada na microscopia de frente de onda de grade cruzada (CGM), foi demonstrada em uma dúzia de artigos publicados na última década37,38,39,40,41,42,43.
Esquema de instalação de aquecimento a laser paralelo, modelagem e microscópio de temperatura. b Geometria da amostra constituída por uma câmara AttofluorTM contendo uma lamela revestida com nanopartículas de ouro. c Observe atentamente a amostra (sem escala). d representa o perfil uniforme do feixe de laser e (e) a distribuição de temperatura subsequente simulada no plano da amostra das nanopartículas de ouro. f é um perfil de feixe de laser anular adequado para gerar uma temperatura uniforme conforme mostrado na simulação da distribuição de temperatura resultante mostrada em (g). Barra de escala: 30 μm.
Em particular, recentemente conseguimos aquecimento de células de mamíferos com LA-HTM e CGM e rastreamos respostas de choque térmico celular na faixa de 37-42°C, demonstrando a aplicabilidade desta técnica para imagens de células vivas únicas. No entanto, a aplicação do LA-HTM ao estudo de microrganismos a altas temperaturas não é inequívoca, pois requer mais cautela em comparação com células de mamíferos: em primeiro lugar, o aquecimento do fundo do meio em dezenas de graus (em vez de alguns graus) leva a um forte gradiente vertical de temperatura. pode criar convecção de fluido 44 que, se não estiver firmemente fixada ao substrato, pode causar movimento indesejável e mistura de bactérias. Esta convecção pode ser eliminada reduzindo a espessura da camada líquida. Para tanto, em todos os experimentos apresentados a seguir, suspensões bacterianas foram colocadas entre duas lamínulas de aproximadamente 15 µm de espessura colocadas dentro de um copo de metal (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Em princípio, a convecção pode ser evitada se a espessura do líquido for menor que o tamanho do feixe do laser de aquecimento. Em segundo lugar, trabalhar numa geometria tão limitada pode sufocar organismos aeróbicos (ver Fig. S2). Este problema pode ser evitado usando um substrato que seja permeável ao oxigênio (ou qualquer outro gás vital), deixando bolhas de ar presas dentro da lamela, ou fazendo furos na lamela superior (ver Fig. S1) 45 . Neste estudo, escolhemos a última solução (Figuras 1b e S1). Finalmente, o aquecimento a laser não proporciona distribuição uniforme de temperatura. Mesmo na mesma intensidade do feixe de laser (Fig. 1d), a distribuição de temperatura não é uniforme, mas se assemelha à distribuição gaussiana devido à difusão térmica (Fig. 1e). Quando o objetivo é estabelecer temperaturas precisas no campo de visão para estudar sistemas biológicos, perfis irregulares não são ideais e também podem levar ao movimento termoforético de bactérias se não aderirem ao substrato (ver Fig. S3, S4) . Para tanto, utilizamos um modulador de luz espacial (SLM) para moldar o feixe de laser infravermelho de acordo com o formato do anel (Fig. 1f) no plano da amostra para obter uma distribuição de temperatura perfeitamente uniforme dentro de uma determinada área geométrica, apesar da difusão térmica (Fig. 1d) 39, 42, 46. Coloque uma lamela superior sobre um prato de metal (Figura 1b) para evitar a evaporação do meio e observe por pelo menos alguns dias. Como esta lamela superior não está selada, o meio adicional pode ser facilmente adicionado a qualquer momento, se necessário.
Para ilustrar como o LA-HTM funciona e demonstrar a sua aplicabilidade na investigação termofílica, estudámos a bactéria aeróbica Geobacillus stearothermophilus, que tem uma temperatura óptima de crescimento em torno de 60-65°C. A bactéria também possui flagelos e capacidade de nadar, fornecendo outro indicador da atividade celular normal.
As amostras (Fig. 1b) foram pré-incubadas a 60 ° C durante uma hora e depois colocadas num porta-amostras LA-HTM. Esta pré-incubação é opcional, mas ainda útil, por duas razões: Primeiro, quando o laser é ligado, faz com que as células cresçam e se dividam imediatamente (ver filme M1 em Materiais Suplementares). Sem pré-incubação, o crescimento bacteriano é normalmente retardado em cerca de 40 minutos cada vez que uma nova área de visualização é aquecida na amostra. Em segundo lugar, a pré-incubação de 1 hora promoveu a adesão das bactérias à lamela, evitando que as células saíssem do campo de visão devido à termoforese quando o laser foi ligado (ver filme M2 em Materiais Suplementares). A termoforese é o movimento de partículas ou moléculas ao longo de um gradiente de temperatura, geralmente de quente para frio, e as bactérias não são exceção43,47. Este efeito indesejável é eliminado em uma determinada área usando SLM para moldar o feixe de laser e obter uma distribuição de temperatura plana.
Na fig. A Figura 2 mostra a distribuição de temperatura medida por CGM obtida pela irradiação de um substrato de vidro revestido com nanopartículas de ouro com um feixe de laser anular (Fig. 1f). Uma distribuição plana de temperatura foi observada em toda a área coberta pelo feixe de laser. Esta zona foi ajustada para 65°C, a temperatura ideal de crescimento. Fora desta região, a curva de temperatura cai naturalmente para \(1/r\) (onde \(r\) é a coordenada radial).
um mapa de temperatura de medições CGM obtido usando um feixe de laser anular para irradiar uma camada de nanopartículas de ouro para obter um perfil de temperatura plano sobre uma área circular. b Isoterma do mapa de temperatura (a). O contorno do feixe de laser é representado por um círculo pontilhado cinza. O experimento foi repetido duas vezes (ver Materiais Suplementares, Figura S4).
A viabilidade das células bacterianas foi monitorizada durante várias horas utilizando LA-HTM. Na fig. 3 mostra o intervalo de tempo para quatro imagens tiradas de um filme de 3 horas e 20 minutos (Filme M3, Informações Suplementares). Observou-se que as bactérias proliferavam ativamente dentro da área circular definida pelo laser onde a temperatura era ideal, aproximando-se de 65°C. Em contraste, o crescimento celular foi significativamente reduzido quando a temperatura caiu abaixo de 50°C durante 10 s.
Imagens de profundidade óptica de bactérias G. stearothermophilus crescendo após aquecimento a laser em tempos diferentes, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, de 200 Extraído de um filme de um minuto (filme M3 fornecido em Informações Suplementares) sobreposto ao mapa de temperatura correspondente. O laser liga no instante \(t=0\). Isotermas foram adicionadas à imagem de intensidade.
Para quantificar ainda mais o crescimento celular e sua dependência da temperatura, medimos o aumento na biomassa de várias colônias de bactérias inicialmente isoladas no campo de visão do Filme M3 (Fig. 4). As bactérias parentais selecionadas no início da formação da unidade formadora de minicolônias (mCFU) são mostradas na Figura S6. As medições de massa seca foram feitas com uma câmera CGM 48 que foi usada para mapear a distribuição de temperatura. A capacidade do CGM de medir peso seco e temperatura é o ponto forte do LA-HTM. Como esperado, a alta temperatura causou um crescimento bacteriano mais rápido (Fig. 4a). Conforme mostrado no gráfico semi-log da Fig. 4b, o crescimento em todas as temperaturas segue o crescimento exponencial, onde os dados usam a função exponencial \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), onde \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – tempo de geração (ou tempo de duplicação), \( g =1/ \tau\) – taxa de crescimento (número de divisões por unidade de tempo). Na fig. 4c mostra a respectiva taxa de crescimento e tempo de geração em função da temperatura. Os mCFUs de crescimento rápido são caracterizados pela saturação do crescimento após duas horas, um comportamento esperado devido à alta densidade bacteriana (semelhante à fase estacionária em culturas líquidas clássicas). A forma geral \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) corresponde à curva bifásica esperada para G. stearothermophilus com uma taxa de crescimento ótima em torno de 60-65°C. Combine os dados usando um modelo cardinal (Figura S5)49 onde \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, o que concorda bem com outros valores citados na literatura49. Embora os parâmetros dependentes da temperatura sejam reproduzíveis, a taxa máxima de crescimento de \({G}_{0}\) pode variar de um experimento para outro (ver figuras S7-S9 e filme M4). Em contraste com os parâmetros de ajuste de temperatura, que deveriam ser universais, a taxa máxima de crescimento depende das propriedades do meio (disponibilidade de nutrientes, concentração de oxigênio) dentro da geometria observada em microescala.
a Crescimento microbiano em várias temperaturas. mCFU: Unidades Formadoras de Colônias em Miniatura. Dados obtidos a partir de um vídeo de uma única bactéria crescendo em um gradiente de temperatura (filme M3). b Igual a (a), escala semilogarítmica. c Taxa de crescimento\(\tau\) e tempo de geração\(g\) calculado a partir de regressão linear (b). Barras de erro horizontais: faixa de temperatura na qual os mCFUs se expandiram no campo de visão durante o crescimento. Barras de erro verticais: erro padrão de regressão linear.
Além do crescimento normal, algumas bactérias às vezes apareciam durante o aquecimento a laser, o que é um comportamento esperado para bactérias com flagelos. O filme M5 em informações adicionais mostra essas atividades de natação. Neste experimento, radiação laser uniforme foi utilizada para criar um gradiente de temperatura, conforme mostrado nas Figuras 1d, e e S3. A Figura 5 mostra duas sequências de imagens selecionadas do filme M5 mostrando que uma bactéria exibe movimento direcional enquanto todas as outras bactérias permanecem imóveis.
Os dois intervalos de tempo (a) e (b) mostram a natação de duas bactérias diferentes marcadas com círculos pontilhados. As imagens foram extraídas do filme M5 (fornecido como material suplementar).
No caso de G. stearothermophilus, o movimento ativo das bactérias (Fig. 5) começou alguns segundos após o feixe de laser ser ligado. Esta observação enfatiza a resposta temporal deste microrganismo termofílico ao aumento da temperatura, como já observado por Mora et al. 24 . O tópico da motilidade bacteriana e até mesmo da termotaxia pode ser mais explorado usando LA-HTM.
A natação microbiana não deve ser confundida com outros tipos de movimento físico, nomeadamente (i) movimento browniano, que parece ser um movimento caótico sem direção definida, (ii) convecção 50 e termoforese 43, que consiste num desvio regular de movimento ao longo de uma temperatura. gradiente.
G. stearothermophilus é conhecido por sua capacidade de produzir esporos altamente resistentes (formação de esporos) quando exposto a condições ambientais adversas como forma de defesa. Quando as condições ambientais voltam a ser favoráveis, os esporos germinam, formando células vivas e retomando o crescimento. Embora este processo de esporulação/germinação seja bem conhecido, nunca foi observado em tempo real. Utilizando LA-HTM, relatamos aqui a primeira observação de eventos de germinação em G. stearothermophilus.
Na fig. 6a mostra imagens de lapso de tempo de profundidade óptica (OT) obtidas usando um conjunto CGM de 13 esporos. Durante todo o tempo de coleta (15 h 6 min, \(t=0\) – início do aquecimento a laser), 4 dos 13 esporos germinaram, em momentos sucessivos \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' e \(11\) h \(30\)'. Embora apenas um desses eventos seja mostrado na Figura 6, 4 eventos de germinação podem ser observados no filme M6 no material suplementar. Curiosamente, a germinação parece ser aleatória: nem todos os esporos germinam e não germinam ao mesmo tempo, apesar das mesmas mudanças nas condições ambientais.
a Time-lapse composto por 8 imagens OT (imersão em óleo, 60x, objetiva de 1,25 NA) e (b) evolução da biomassa de agregados de G. stearothermophilus. c (b) Desenhado em escala semilogarítmica para destacar a linearidade da taxa de crescimento (linha tracejada).
Na fig. 6b,c mostra a biomassa das populações de células no campo de visão em função do tempo durante todo o período de coleta de dados. O rápido decaimento da massa seca observado em \(t=5\)h na fig. 6b, c, devido à saída de algumas células do campo de visão. A taxa de crescimento desses quatro eventos é \(0,77\pm 0,1\) h-1. Este valor é superior à taxa de crescimento associada à Figura 3.3 e 4, onde as células crescem normalmente. A razão para o aumento da taxa de crescimento de G. stearothermophilus a partir de esporos não é clara, mas essas medições destacam o interesse do LA-HTM e trabalham no nível de célula única (ou no nível de mCFU único) para aprender mais sobre a dinâmica da vida celular .
Para demonstrar ainda mais a versatilidade do LA-HTM e seu desempenho em altas temperaturas, examinamos o crescimento de Sulfolobus shibatae, uma archaea acidofílica hipertermofílica com uma temperatura ótima de crescimento de 80°C51. Em comparação com G. stearothermophilus, essas archaea também têm uma morfologia muito diferente, assemelhando-se a esferas de 1 mícron (cocos) em vez de bastonetes alongados (bacilos).
A Figura 7a consiste em imagens sequenciais de profundidade óptica de S. shibatae mCFU obtidas usando CGM (ver longa-metragem M7 em Materiais Suplementares). Este mCFU cresce a cerca de 73°C, abaixo da temperatura ideal de 80°C, mas dentro da faixa de temperatura para crescimento ativo. Observamos vários eventos de fissão que fizeram os mCFUs parecerem micrograpes de archaea após algumas horas. A partir destas imagens de OT, a biomassa de mCFU foi medida ao longo do tempo e apresentada na Figura 7b. Curiosamente, os mCFUs de S. shibatae mostraram crescimento linear em vez do crescimento exponencial observado com mCFUs de G. stearothermophilus. Tem havido uma discussão de longa data 52 sobre a natureza das taxas de crescimento celular: enquanto alguns estudos relatam taxas de crescimento de micróbios que são proporcionais ao seu tamanho (crescimento exponencial), outros mostram uma taxa constante (crescimento linear ou bilinear). Conforme explicado por Tzur et al.53, distinguir entre crescimento exponencial e (bi)linear requer uma precisão <6% nas medições de biomassa, o que está fora do alcance da maioria das técnicas de QPM, mesmo envolvendo interferometria. Conforme explicado por Tzur et al.53, distinguir entre crescimento exponencial e (bi)linear requer uma precisão <6% nas medições de biomassa, o que está fora do alcance da maioria das técnicas de QPM, mesmo envolvendo interferometria. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)lineneйного роста требует точности <6% em измерения х биомассы, что недостижимо for большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Conforme explicado por Zur et al.53, distinguir entre crescimento exponencial e (bi)linear requer precisão <6% nas medições de biomassa, o que é inatingível para a maioria dos métodos QPM, mesmo usando interferometria.Conforme explicado por Zur et al. 53, distinguir entre crescimento exponencial e (bi)linear requer menos de 6% de precisão nas medições de biomassa, o que é inatingível para a maioria dos métodos QPM, mesmo quando a interferometria é usada. O CGM atinge essa precisão com precisão sub-pg em medições de biomassa36,48.
um lapso de tempo composto por 6 imagens OT (imersão em óleo, 60x, objetivo NA 1,25) e (b) evolução da biomassa micro-CFU medida com CGM. Veja o filme M7 para mais informações.
O crescimento perfeitamente linear de S. shibatae foi inesperado e ainda não foi relatado. No entanto, espera-se um crescimento exponencial, pelo menos porque, ao longo do tempo, devem ocorrer múltiplas divisões de 2, 4, 8, 16… células. Nossa hipótese é que o crescimento linear pode ser devido à inibição celular devido ao denso empacotamento celular, assim como o crescimento celular desacelera e eventualmente atinge um estado inativo quando a densidade celular é muito alta.
Concluímos discutindo os seguintes cinco pontos de interesse: redução no volume de aquecimento, redução na inércia térmica, interesse em nanopartículas de ouro, interesse em microscopia de fase quantitativa e uma possível faixa de temperatura na qual o LA-HTM pode ser usado.
Comparado ao aquecimento resistivo, o aquecimento a laser utilizado para o desenvolvimento de HTM oferece diversas vantagens, que ilustramos neste estudo. Em particular, em meios líquidos no campo de visão do microscópio, o volume de aquecimento é mantido dentro de alguns (10 μm) 3 volumes. Desta forma, apenas os micróbios observados estão activos, enquanto outras bactérias estão adormecidas e podem ser utilizadas para estudar mais a amostra – não há necessidade de mudar a amostra sempre que for necessário verificar uma nova temperatura. Além disso, o aquecimento em microescala permite o exame direto de uma ampla faixa de temperaturas: a Figura 4c foi obtida a partir de um filme de 3 horas (Filme M3), que normalmente requer a preparação e exame de várias amostras – uma para cada uma das amostras em estudo. y é a temperatura que representa o número de dias do experimento. A redução do volume aquecido também mantém todos os componentes ópticos circundantes do microscópio, especialmente a lente objetiva, à temperatura ambiente, o que tem sido um grande problema enfrentado pela comunidade até agora. LA-HTM pode ser usado com qualquer lente, incluindo lentes de imersão em óleo, e permanecerá em temperatura ambiente mesmo com temperaturas extremas no campo de visão. A principal limitação do método de aquecimento a laser que relatamos neste estudo é que as células que não aderem ou flutuam podem estar longe do campo de visão e serem difíceis de estudar. Uma solução alternativa poderia ser usar lentes de baixa ampliação para obter um aumento de temperatura maior, superior a algumas centenas de mícrons. Esse cuidado vem acompanhado de uma diminuição na resolução espacial, mas se o objetivo é estudar a movimentação de microrganismos, não é necessária alta resolução espacial.
A escala de tempo para aquecer (e resfriar) o sistema \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) depende de seu tamanho, de acordo com a lei \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), onde \ (L\ ) é o tamanho característico da fonte de calor (o diâmetro do feixe de laser em nosso estudo é \(L\ cerca de 100\) μm), \(D\) é a difusividade térmica do ambiente (média em nosso caso, vidro e água Taxa de difusão\(D\ about 2\fold {10}^{-7}\) m2/s). Portanto, neste estudo, respostas temporais da ordem de 50 ms, ou seja, quase instantâneas). mudanças de temperatura, podem ser esperadas. Este estabelecimento instantâneo de aumento de temperatura não apenas encurta a duração do experimento, mas também permite um tempo preciso \(t=0\) para qualquer estudo dinâmico dos efeitos da temperatura.
Nosso método proposto é aplicável a qualquer substrato absorvente de luz (por exemplo, amostras comerciais com revestimento ITO). Porém, as nanopartículas de ouro são capazes de proporcionar alta absorção no infravermelho e baixa absorção na faixa do visível, estas últimas características são de interesse para uma observação óptica eficaz na faixa do visível, especialmente quando se utiliza fluorescência. Além disso, o ouro é biocompatível, quimicamente inerte, a densidade óptica pode ser ajustada de 530 nm ao infravermelho próximo e o preparo da amostra é simples e econômico29.
A microscopia de frente de onda de rede transversal (CGM) permite não apenas o mapeamento da temperatura em microescala, mas também o monitoramento da biomassa, tornando-a particularmente útil (se não necessária) em combinação com o LA-HTM. Na última década, outras técnicas de microscopia de temperatura foram desenvolvidas, especialmente na área de bioimagem, e a maioria delas requer o uso de sondas fluorescentes sensíveis à temperatura54,55. No entanto, estes métodos foram criticados e alguns relatórios mediram mudanças irrealistas de temperatura dentro das células, possivelmente devido ao fato de que a fluorescência depende de muitos outros fatores além da temperatura. Além disso, a maioria das sondas fluorescentes são instáveis em altas temperaturas. Portanto, o QPM e em particular o CGM representam uma técnica de microscopia de temperatura ideal para estudar a vida em altas temperaturas usando microscopia óptica.
Estudos de S. shibatae, que vivem idealmente a 80°C, mostram que o LA-HTM pode ser aplicado para estudar hipertermófilos, não apenas simples termófilos. Em princípio, não há limite para a faixa de temperaturas que podem ser alcançadas usando LA-HTM, e mesmo temperaturas acima de 100°C podem ser alcançadas à pressão atmosférica sem ebulição, como demonstrado pelo nosso grupo de 38 em aplicações de química hidrotérmica em condições atmosféricas. pressão A. Um laser é usado para aquecer nanopartículas de ouro 40 da mesma maneira. Assim, o LA-HTM tem potencial para ser usado para observar hipertermófilos sem precedentes com microscopia óptica padrão de alta resolução sob condições padrão (ou seja, sob estresse ambiental).
Todos os experimentos foram realizados utilizando microscópio caseiro, incluindo iluminação Köhler (com LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), porta-amostras com movimento xy manual, objetivas (Olympus, 60x, 0,7 NA, ar, LUCPlanFLN60X ou 60x, 1,25 NA, Óleo , UPLFLN60XOI), câmera CGM (grade cruzada QLSI, passo de 39 µm, 0,87 mm do sensor de câmera Andor Zyla) para fornecer imagens de intensidade e frente de onda, e câmera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, modo de 16 bits, de Hamamatsu) para gravar o dados mostrados na Figura 5 (natação bacteriana). O divisor de feixe dicróico é uma borda BrightLine de 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). O filtro na frente da câmera é um filtro passa curto 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser de safira de titânio (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, cavidade de laser de tsunami bombeado, Spectra-Physics na Fig. 2-5, posteriormente substituído por laser Millenia, Spectraphysics 10 W, cavidade de laser Bombeado Mira, Coherent, para Fig. 2 -5). 6 e 7) são definidos para o comprimento de onda \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, que corresponde ao espectro de ressonância plasmônica de nanopartículas de ouro. Moduladores de luz espacial (1920 × 1152 pixels) foram adquiridos da Meadowlark Optics. Os hologramas foram calculados usando o algoritmo Gerchberg-Saxton conforme descrito no link 39.
A microscopia de frente de onda de grade cruzada (CGM) é uma técnica de microscopia óptica baseada na combinação de uma rede de difração bidimensional (também conhecida como grade cruzada) a uma distância de um milímetro do sensor de uma câmera convencional. O exemplo mais comum de um CGM que usamos neste estudo é chamado de interferômetro de deslocamento transversal de quatro comprimentos de onda (QLSI), onde a rede cruzada consiste em um padrão xadrez de intensidade/fase introduzido e patenteado por Primot et al. em 200034. As linhas de grade verticais e horizontais criam sombras em forma de grade no sensor, cuja distorção pode ser processada numericamente em tempo real para obter a distorção óptica da frente de onda (ou perfil de fase equivalente) da luz incidente. Quando usada em um microscópio, uma câmera CGM pode exibir a diferença do caminho óptico de um objeto fotografado, também conhecida como profundidade óptica (OT), com uma sensibilidade da ordem de nanômetros . Em qualquer medição CGM, a fim de eliminar quaisquer defeitos nos componentes ópticos ou feixes, uma imagem OT de referência primária deve ser obtida e subtraída de quaisquer imagens subsequentes.
A microscopia de temperatura foi realizada utilizando uma câmera CGM conforme descrito na referência. 32. Resumindo, o aquecimento de um líquido altera o seu índice de refração, criando um efeito de lente térmica que distorce o feixe incidente. Esta distorção da frente de onda é medida pelo CGM e processada usando um algoritmo de deconvolução para obter uma distribuição tridimensional de temperatura no meio líquido. Se as nanopartículas de ouro estiverem distribuídas uniformemente pela amostra, o mapeamento da temperatura pode ser feito em áreas livres de bactérias para produzir imagens melhores, que é o que às vezes fazemos. A imagem CGM de referência foi adquirida sem aquecimento (com o laser desligado) e posteriormente capturada no mesmo local da imagem com o laser ligado.
A medição da massa seca é obtida usando a mesma câmera CGM usada para imagens de temperatura. Imagens de referência CGM foram obtidas movendo rapidamente a amostra em x e y durante a exposição como meio de calcular a média de qualquer falta de homogeneidade no OT devido à presença de bactérias. A partir de imagens OT de bactérias, sua biomassa foi obtida usando um conjunto de imagens sobre áreas selecionadas usando o algoritmo de segmentação caseiro do Matlab (ver subseção “Código numérico”), seguindo o procedimento descrito na ref. 48. Resumindo, usamos a relação \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), onde \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) é a imagem de profundidade óptica, \(m\) é o peso seco e \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) é uma constante. Escolhemos \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, que é uma constante típica para células vivas.
Uma lamínula de 25 mm de diâmetro e 150 µm de espessura revestida com nanopartículas de ouro foi colocada em uma câmara AttofluorTM (Thermofisher) com as nanopartículas de ouro voltadas para cima. Geobacillus stearothermophilus foi pré-cultivado durante a noite em meio LB (200 rpm, 60°C) antes de cada dia de experiências. Uma gota de 5 µl de uma suspensão de G. stearothermophilus com densidade óptica (DO) de 0,3 a 0,5 foi colocada sobre uma lamínula com nanopartículas de ouro. Em seguida, uma lamínula redonda de 18 mm de diâmetro com um orifício de 5 mm de diâmetro no centro foi colocada sobre a gota e 5 μl de suspensão bacteriana com a mesma densidade óptica foram repetidamente aplicados no centro do orifício. Os poços nas lamelas foram preparados de acordo com o procedimento descrito na ref. 45 (ver Informações Suplementares para mais informações). Em seguida, adicione 1 ml de meio LB à lamela para evitar que a camada líquida seque. A última lamela é colocada sobre a tampa fechada da câmara Attofluor™ para evitar a evaporação do meio durante a incubação. Para experimentos de germinação, utilizamos esporos que, após experimentos convencionais, às vezes cobriam a lamela superior. Um método semelhante foi usado para obter Sulfolobus shibatae. Foram realizados três dias (200 rpm, 75°C) de cultivo preliminar de Thiobacillus serrata em meio 182 (DSMZ).
Amostras de nanopartículas de ouro foram preparadas por litografia de copolímero em bloco micelar. Este processo é descrito em detalhes no Cap. 60. Resumidamente, micelas encapsulando íons de ouro foram sintetizadas misturando o copolímero com HAuCl4 em tolueno. As lamínulas limpas foram então imersas na solução e tratadas com irradiação UV na presença de um agente redutor para obtenção de sementes de ouro. Finalmente, as sementes de ouro foram cultivadas colocando uma lamela em contato com uma solução aquosa de KAuCl4 e etanolamina por 16 minutos, o que resultou em um arranjo quase periódico e muito uniforme de nanopartículas de ouro não esféricas no infravermelho próximo.
Para converter os interferogramas em imagens de TO, utilizamos um algoritmo caseiro, conforme detalhado no link. 33 e está disponível como um pacote Matlab no seguinte repositório público: https://github.com/baffou/CGMprocess. O pacote pode calcular imagens de intensidade e OT com base em interferogramas gravados (incluindo imagens de referência) e distâncias de conjuntos de câmeras.
Para calcular o padrão de fase aplicado ao SLM para obter um determinado perfil de temperatura, utilizamos um algoritmo caseiro previamente desenvolvido39,42 que está disponível no seguinte repositório público: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. A entrada é o campo de temperatura desejado, que pode ser configurado digitalmente ou através de uma imagem bmp monocromática.
Para segmentar as células e medir seu peso seco, utilizamos nosso algoritmo Matlab publicado no seguinte repositório público: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Em cada imagem, o usuário deve clicar na bactéria ou mCFU de interesse, ajustar a sensibilidade da varinha e confirmar a seleção.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do Nature Research Report vinculado a este artigo.
Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis aos respectivos autores mediante solicitação razoável.
O código-fonte usado neste estudo é detalhado na seção Métodos, e as versões de depuração podem ser baixadas de https://github.com/baffou/ nos seguintes repositórios: SLM_temperatureShaping, CGMprocess e CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sobre termófilos e suas aplicações de amplo espectro. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sobre termófilos e suas aplicações de amplo espectro.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. e Sharma, AK Visão geral dos termófilos e sua ampla aplicação. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. e Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. e Sharma AK Um profundo conhecimento de termófilos e uma ampla gama de aplicações.3 Biotecnologia 6, 81 (2016).
Horário da postagem: 26 de setembro de 2022